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Estructura y composición
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Como su nombre lo indica, los microtúbulos son estructuras tubulares huecas y se encuentran en casi todas las células eucariotas. Los microtúbulos forman parte de diversas estructuras, como el huso mitótico de las células en división y el centro de cilios y flagelos. Los microtúbulos tienen un diámetro externo de 25 nm, una pared con grosor aproximado de 4 nm y pueden extenderse a lo largo o ancho de la célula. La pared de un microtúbulo está formada por proteínas globulares dispuestas en hileras longitudinales, conocidas como protofilamentos, que se alinean en paralelo con respecto al eje longitudinal del túbulo (fig. 9.9a). Cuando se observan en un corte transversal, puede verse que los microtúbulos están formados por 13 protofilamentos alineados lado a lado en un círculo dentro de la pared (fig. 9.9b). Se cree que las interacciones no covalentes entre protofilamentos adyacentes tienen una función importante para mantener la estructura del microtúbulo.
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Cada protofilamento se ensambla a partir de bloques diméricos de construcción consistentes en una subunidad tubulina alfa y una tubulina beta. Los dos tipos de subunidades de tubulina tienen una estructura tridimensional similar y se acomodan con fuerza como se muestra en la figura 9.9c. Los dímeros de tubulina se organizan en un patrón lineal a lo largo de cada protofilamento, observándose esto en la figura 9.9d. Ya que cada unidad de ensamble contiene dos componentes no idénticos (un heterodímero), el protofilamento es asimétrico, con una tubulina alfa en un extremo y una tubulina beta en el otro. Todos los protofilamentos de un microtúbulo poseen la misma polaridad. Por consiguiente, todo el polímero tiene la misma polaridad. Un extremo del microtúbulo se conoce como el extremo más y termina con una fila de subunidades beta (fig. 9.9d). El extremo contrario es el extremo menos y concluye con una fila de subunidades de tubulina alfa. Como se explica más adelante en el capítulo, la polaridad estructural de los microtúbulos es un factor importante en el crecimiento de estas estructuras y su capacidad para participar en actividades mecánicas dirigidas.
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Proteínas asociadas con los microtúbulos
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Por lo general los microtúbulos preparados a partir de tejido vivo contienen proteínas adicionales, llamadas proteínas asociadas con microtúbulos (MAP, microtubule-associated proteins). Las MAP comprenden un conjunto heterogéneo de proteínas. Las primeras MAP que se identificaron se conocen como “MAP clásicas” y casi siempre tienen un dominio que se une con la parte lateral de un microtúbulo y otro dominio que se proyecta hacia fuera como filamento desde la superficie del microtúbulo. La figura 9.10 muestra la unión de estas MAP con la superficie del microtúbulo. Algunas MAP pueden verse en micrografías electrónicas como puentes que conectan los microtúbulos entre sí, lo que mantiene su alineación paralela. Las MAP suelen incrementar la estabilidad de los microtúbulos y promover su ensamble. La actividad de unión con microtúbulos de las diversas MAP se controla sobre todo con la adición y el retiro de grupos fosfato de residuos de aminoácidos particulares. Un nivel demasiado alto de fosforilación de una MAP particular llamada tau se implicó en el desarrollo de varios trastornos neurodegenerativos letales, incluida la enfermedad de Alzheimer (pág. 67). Las células cerebrales de las personas con estas enfermedades contienen filamentos extraños y enredados (marañas neurofibrilares) formados por moléculas tau con fosforilación excesiva e incapaces de unirse con los microtúbulos. Al parecer, los filamentos neurofibrilares contribuyen a la muerte de las células nerviosas. Las personas con una de estas enfermedades, la demencia hereditaria FTDP-17, tienen mutaciones en el gen tau, lo que indica que la alteración de la proteína tau es la causa primaria de este trastorno.
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Microtúbulos como soportes y organizadores estructurales
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Los microtúbulos son lo bastante rígidos para resistir fuerzas que pudieran comprimir o doblar la fibra. Esta propiedad les permite brindar soporte mecánico, tal como las vigas de acero sostienen un edificio alto de oficinas o los postes que sostienen la estructura de una tienda. La distribución de los microtúbulos citoplásmicos en una célula ayuda a determinar la forma de la misma. En células animales cultivadas, los microtúbulos se extienden con un patrón radial desde el área alrededor del núcleo hacia la periferia, lo que confiere su forma redondeada y aplanada a estas células (fig. 9.11). En cambio, los microtúbulos de las células epiteliales cilíndricas casi siempre están orientados con el eje longitudinal paralelo al eje mayor de la célula (fig. 9.1a). Esta configuración sugiere que los microtúbulos ayudan a mantener la forma alargada de la célula. La función de los microtúbulos como elementos esqueléticos es evidente en ciertos procesos celulares muy alargados, como los cilios y los flagelos, o los axones de las neuronas.
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En las células vegetales los microtúbulos desempeñan una función indirecta en el mantenimiento de la forma celular mediante su influencia en la formación de la pared celular. Durante la interfase, la mayor parte de los microtúbulos de una célula vegetal se localiza justo debajo de la membrana plasmática (como en la figura 9.9b) y forma una zona cortical distintiva. Se cree que los microtúbulos de la corteza influyen en el movimiento de las enzimas que sintetizan celulosa y que se localizan en la membrana plasmática (véase fig. 7.37). Como resultado las microfibrillas de celulosa de la pared celular se ensamblan con una orientación paralela a los microtúbulos subyacentes de la corteza (fig. 9.12). La orientación de estas microfibrillas de celulosa tiene una participación importante en la determinación de las características de crecimiento de la célula y, por lo tanto, en su forma. En casi todas las células las microfibrillas de celulosa recién sintetizadas y los microtúbulos alineados se disponen en dirección perpendicular con el eje longitudinal de la célula (transversal), como aros alrededor de un barril (fig. 9.12). Como las microfibrillas de celulosa resisten la expansión natural, la presión de turgencia que ejerce el líquido en la vacuola celular se dirige a los extremos de la célula, lo que produce su elongación.
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También se cree que los microtúbulos participan en el mantenimiento de la organización interna de las células. El tratamiento de las células con agentes que desorganizan los microtúbulos puede afectar mucho la localización de organelos membranosos, inclusive el retículo endoplásmico y el aparato de Golgi. De forma típica, el complejo de Golgi está organizado como una sola “franja” situada cerca del centro de las células de mamíferos (consúltese la fig. 8.20c), exactamente a un lado del núcleo. El tratamiento de las células con nocodazol o con colchicina que “desorganizan” los microtúbulos, separará los elementos del sistema de Golgi en “cúmulos” dispersos en todo el citoplasma. Las membranas del aparato de Golgi regresan a su posición normal en el interior de la célula cuando el fármaco se retira y los microtúbulos se reensamblan.
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Microtúbulos como agentes de movilidad intracelular
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Las células vivas están repletas de actividad, mientras las macromoléculas y los organelos se mueven de manera dirigida de un sitio a otro. Aunque todo este ajetreo puede apreciarse al observar el movimiento de materiales específicos en una célula viva, los procesos subyacentes suelen ser difíciles de estudiar porque la mayor parte de las células carece de un citoesqueleto muy ordenado. Por ejemplo, se sabe que el transporte de materiales de un compartimiento de membrana a otro depende de la presencia de microtúbulos, porque la interrupción específica de estos elementos citoesqueléticos detiene los movimientos. El estudio de la movilidad intracelular se iniciará con las células nerviosas, cuyos movimientos intracelulares dependen de un conjunto muy organizado de microtúbulos y otros filamentos del citoesqueleto.
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El axón de una neurona motora individual puede prolongarse desde la médula espinal hasta la punta de un dedo de la mano o del pie. El centro de manufactura de esta neurona es su cuerpo celular, una porción redondeada de la célula que se encuentra dentro de la médula espinal. Cuando se inyectan aminoácidos marcados en el cuerpo celular, se incorporan a proteínas marcadas que se mueven hacia el axón y viajan por toda su extensión. Muchos materiales distintos, entre ellos moléculas neurotransmisoras, se incluyen en los compartimientos dentro de vesículas membranosas en el retículo endoplásmico y el aparato de Golgi del cuerpo celular y luego se transportan por toda la longitud del axón (fig. 9.13a). Los cargamentos que no se unen a membranas, como el RNA, los ribosomas y elementos del citoesqueleto, también se transportan por esta vasta extensión de citoplasma alargado. Los diferentes materiales se mueven a distintos ritmos y el transporte axónico más rápido alcanza velocidades de 5 μm por segundo. A este ritmo, una vesícula sináptica jalada por proteínas motoras de dimensiones nanométricas pueden viajar 40 cm en un solo día, o casi la mitad de la distancia entre la médula espinal y la punta de un dedo. Se dice que las estructuras y los materiales que viajan desde el cuerpo celular hasta las terminaciones de una neurona se mueven en dirección anterógrada. Otras estructuras, como las vesículas endocíticas que se forman en las terminaciones nerviosas y transportan factores desde las células blanco, se mueven en dirección contraria, o retrógrada: desde la sinapsis hacia el cuerpo celular. Los defectos en el transporte anterógrado y retrógrado se han vinculado con varias afecciones neurológicas.
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Los axones están llenos de estructuras del citoesqueleto, inclusive haces de microfilamentos, filamentos intermedios y microtúbulos interconectados de varias maneras (fig. 9.13b,c). Con la videomicroscopia, los investigadores pueden seguir vesículas individuales mientras se mueven a lo largo de los microtúbulos de un axón, ya sea hacia el cuerpo celular o en sentido contrario (fig. 9.14). Estos movimientos son mediados principalmente por microtúbulos (fig. 9.13c), que sirven como vías para diversas proteínas motoras que generan las fuerzas necesarias a fin de mover objetos dentro de una célula. El estudio de las proteínas motoras es un tema central de la biología celular y molecular; se cuenta con mucha información de la naturaleza de estas moléculas, así como de su mecanismo de acción, que son los temas de la sección siguiente.
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Proteínas motoras que cruzan el citoesqueleto microtubular
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Las proteínas motoras de una célula convierten la energía química (almacenada en forma de ATP) en energía mecánica, que se emplea para mover el cargamento celular unido al motor. Los tipos de cargamento celular que estas proteínas transportan comprenden vesículas, mitocondrias, lisosomas, cromosomas y otros filamentos del citoesqueleto. Una sola célula puede contener cien proteínas motoras diferentes, cada una supuestamente especializada en una actividad distinta, como el movimiento de tipos particulares de cargamento en una región específica de la célula. En conjunto, las proteínas motoras pueden agruparse en tres grandes familias: cinesinas, dineínas y miosinas. Las cinesinas y las dineínas se mueven a lo largo de los microtúbulos, en tanto que las miosinas lo hacen a lo largo de microfilamentos. No se conoce ningún motor proteínico que utilice los filamentos intermedios como rieles. Esto no resulta sorprendente si se considera que los filamentos intermedios no están polarizados y por lo tanto, no proporcionan señales direccionales al motor.
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Las proteínas motoras se mueven por pasos en una sola dirección a lo largo del riel de citoesqueleto, de un sitio de unión al siguiente. Conforme la proteína avanza, experimenta varios cambios en la conformación que constituyen un ciclo mecánico. Los pasos del ciclo mecánico se coordinan con los pasos de un ciclo químico (o catalítico), el cual proporciona la energía necesaria para impulsar la actividad del motor (véase la figura 9.61 para un ejemplo). Los pasos del ciclo químico abarcan la unión de una molécula de ATP con el motor, la hidrólisis de ATP, la liberación de los productos (ADP y Pi) del motor y la unión de una nueva molécula de ATP. La unión e hidrólisis de una sola molécula de ATP en el sitio catalítico se emplea para generar un pulso de energía que mueve el motor un número preciso de nanómetros sobre el riel. Conforme la proteína motora se mueve a los sitios sucesivos sobre el polímero del citoesqueleto, los ciclos mecánico y químico se repiten una y otra vez, lo que tira del cargamento distancias considerables. Hay que tener presente que se trata de motores de tamaño molecular que, a diferencia de las máquinas hechas por el hombre, dependen mucho de su ambiente. Por ejemplo, las proteínas motoras no tienen momento y están sujetas a una resistencia por fricción enorme por su ambiente viscoso. Como resultado, una proteína motora se detiene casi de inmediato una vez que el aporte de energía cesa.
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Se iniciará con la revisión de la estructura molecular y las funciones de las cinesinas, las más pequeñas y mejor comprendidas de los motores microtubulares.
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En 1985, Ronald Vale y colaboradores aislaron una proteína motora del citoplasma de los axones de calamar gigante que usaban los microtúbulos como rieles. Esta proteína se denominó cinesina y luego se encontró en casi todas las células eucariotas. La molécula de cinesina descubierta en 1985, a la que se ha llamado “cinesina corriente” o cinesina-1, es un miembro de una superfamilia de proteínas similares llamadas proteínas relacionadas con cinesina (KRP, kinesin-related proteins), y se clasifican en 14 familias (de la cinesina-1 a la 14). En los comentarios que haremos el uso del término cinesina, lo aplicaremos sólo a miembros de la familia de cinesina-1.
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Cada molécula de cinesina-1 es un tetrámero compuesto de dos cadenas pesadas idénticas y otras dos ligeras también idénticas (fig. 9.15a). Una molécula de cinesina tiene varias partes, incluido un par de cabezas globulares que se unen a un microtúbulo y actúan como “máquinas” generadoras de fuerza que hidrolizan ATP. Cada cabeza (o dominio motor) se conecta con un cuello, un pedúnculo cilíndrico y una cola con forma de abanico que se une al cargamento que debe moverse (fig. 9.15a). Los segmentos motores de todas las KRP tienen secuencias similares de aminoácidos, lo cual refleja su origen evolutivo común y su actuación similar para desplazarse sobre los microtúbulos. A diferencia de ello, los segmentos caudales de KRP tienen secuencias diferentes que reflejan la variedad de “cargamentos” que acarrean tales elementos motores. Se han identificado proteínas diferentes como posibles adaptadoras que vinculan KRP específicas y el “cargamento”. Algo sorprendente es que el dominio motor de la cinesina tiene una estructura muy similar a la de la miosina, a pesar del hecho de que las cinesinas son proteínas mucho más pequeñas y los dos tipos de motores operan en rieles distintos. Es casi seguro que la cinesina y la miosina evolucionaron de una proteína ancestral común presente en alguna célula eucariota primitiva.
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Cuando se observan las moléculas de cinesina purificada en una prueba de motilidad in vitro, las proteínas motoras se mueven a lo largo de microtúbulos hacia su extremo más (fig. 9.6). Por lo tanto, se dice que la cinesina es un motor microtubular dirigido al lado más. En un axón, donde todos los microtúbulos están orientados con su extremo menos (–) hacia el cuerpo celular, la cinesina transporta vesículas y otros cargamentos hacia las terminaciones sinápticas. El descubrimiento de la cinesina se comenta en “Vías experimentales”, que se puede encontrar en la red en la liga www.wiley.com/college/karp.
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Una sola molécula de cinesina se mueve sobre un solo protofilamento de un microtúbulo a una velocidad proporcional a la concentración de ATP (hasta una velocidad máxima de 1 μm por segundo). Cuando las concentraciones de ATP son bajas, las moléculas de cinesina se desplazan con suficiente lentitud para que los observadores concluyan que la proteína se mueve por pasos (fig. 9.15b). Cada paso es de unos 8 nm de largo, que también es la longitud de un dímero de tubulina en un protofilamento y requiere la hidrólisis de una sola molécula de ATP. En la actualidad se acepta de manera general que la cinesina se mueve por un mecanismo “mano sobre mano” que se muestra en la figura 9.15b. Conforme a este modelo, que es básicamente similar a una persona que sube por una cuerda, las dos cabezas se alternan para tomar la primera o la segunda posiciones sin una rotación acompañante del tallo y la carga en cada paso.
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El movimiento de las moléculas de cinesina, tanto in vitro como in vivo, es muy progresivo, lo que significa que la proteína motora tiende a moverse a lo largo de un microtúbulo individual por distancias considerables (más de 1 μm) sin desprenderse. Una molécula de cinesina de dos cabezas puede lograr esta hazaña porque una de las cabezas está unida con el microtúbulo en todo momento (fig. 9.15b). Una proteína motora con esta capacidad está bien adaptada para el transporte independiente y por largas distancias de pequeños paquetes de cargamento.
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Las dos cabezas de la molécula de la cinesina funcionan en forma coordinada, de modo que siempre están en diferentes etapas de sus ciclos químico y mecánico en cualquier momento dado. Cuando una cabeza se une al microtúbulo, los cambios resultantes de conformación en la región del cuello adyacente de la proteína motora hacen que la otra cabeza se mueva hacia adelante al siguiente sitio de unión en el profilamento. Es probable que la cabeza con desplazamiento anterógrado encuentre su sitio de unión preciso en el protofilamento mediante una búsqueda aleatoria rápida. Estas actividades se ilustran en la figura 9.15c, que presenta las porciones de la cabeza y cuello de la cadena pesada de una cinesina monomérica unida a un microtúbulo. La actividad catalítica de la cabeza produce un movimiento de balanceo del cuello, que en esta ilustración está unido con una molécula de GFP (la proteína verde con forma de barril) y no con el tallo y la cabeza de la segunda cinesina en el dímero. El microtúbulo no es una vía pasiva donde se tienen estos eventos, sino que tiene un papel activo para estimular ciertos pasos de los ciclos mecánico y químico de la molécula de cinesina. Las cinesinas solubles libres adoptan una conformación plegada autoinhibida que necesita interactuar con el cargamento y un microtúbulo, para activarse.
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Como la cinesina-1, la mayor parte de las KLP se mueve hacia el extremo más del microtúbulo al que están unidas. Sin embargo, una pequeña familia (llamada cinesina 14), que incluye la ampliamente estudiada proteína Ncd de Drosophila, se mueve en sentido contrario, esto es, al extremo menos del riel microtubular. Aunque podría esperarse que las cabezas de las KRP dirigidas al extremo más y las dirigidas al extremo menos tuvieran estructuras diferentes porque contienen los dominios motores catalíticos, las cabezas de los dos tipos de proteínas son indistinguibles. En lugar de eso, la discrepancia en la dirección del movimiento se rastreó hasta las diferencias en las regiones adyacentes del cuello de las dos proteínas. Cuando la cabeza de una molécula Ncd dirigida al extremo menos se une con el cuello y el tallo de una molécula de cinesina, la proteína híbrida se mueve hacia el extremo más del riel. Por lo tanto, aunque la híbrida tiene un dominio catalítico que en condiciones normales se movería hacia el extremo menos de un microtúbulo, siempre que esté unido al cuello de un motor hacia el extremo más, se mueve en esta última dirección.
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Una tercera familia pequeña (cinesina-13) de proteínas similares a la cinesina, es incapaz de moverse. Las KRP de este grupo se unen a cualquier extremo de un microtúbulo y causan su despolimerización en vez de moverse por él. Estas proteínas a menudo se denominan despolimerasas de microtúbulos.2 El importante cometido de éstas y otras KRP durante la división celular se revisa en el capítulo 14.
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Transporte de organelos mediado por cinesina En el capítulo 8 se describió cómo se mueven las vesículas de un compartimiento membranoso, como el aparato de Golgi, a otro, como un lisosoma. Los trayectos que las vesículas citoplásmicas y los organelos siguen están definidos por los microtúbulos (véase fig. 9.1); los integrantes de la superfamilia de la cinesina tienen una participación muy importante como agentes generadores de fuerza que impulsa el movimiento de este cargamento limitado por membrana. En la mayor parte de las células, como en los axones, los microtúbulos se alinean con sus extremos más apuntando lejos del centro de la célula. Por lo tanto, los miembros de la superfamilia de cinesina tienden a mover vesículas y organelos (p. ej., peroxisomas y mitocondrias) hacia el exterior, a la membrana plasmática celular. Lo anterior se ilustra en las micrografías de la figura 9.16. El par de micrografías de la izquierda muestra una célula aislada de un embrión normal con 9.5 días de desarrollo que se tiñó para revelar la localización de sus microtúbulos (verde) y mitocondrias (naranja). El par de micrografías de la derecha muestra una célula que se aisló de un embrión de ratón con 9.5 días de desarrollo, pero que carece de ambas copias del gen que codifica la cadena pesada KIF5B de la cinesina. Las mitocondrias de la célula deficiente en KIF5B están ausentes en las regiones periféricas de la célula, como se esperaría si esta cinesina dirigida al extremo más afuera es la encargada del movimiento centrífugo de los organelos membranosos (véase también fig. 9.17c).
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El primer motor asociado a los microtúbulos se descubrió en 1963 como la proteína encargada del movimiento de cilios y flagelos. Esta proteína se denominó dineína. Aunque casi de inmediato se sospechó la existencia de formas citoplásmicas, pasaron 20 años antes que una proteína similar se purificara e identificara en el tejido cerebral de los mamíferos a la que se llamó dineína citoplásmica. Si bien el ser humano tiene muchas cinesinas (y miosinas) diferentes, cada una adaptada para funciones específicas, puede funcionar con sólo dos dineínas citoplásmicas, una de las cuales parece ser responsable de la mayor parte de las operaciones de transporte.
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La dineína citoplásmica es una proteína enorme (su masa molecular se aproxima a 1.5 millones de Da) formada por dos cadenas pesadas idénticas y varias cadenas intermedias y ligeras (fig. 9.17a). Cada cadena pesada de la dineína consiste en una cabeza globular grande con dos proyecciones alargadas (tallos). La cabeza de la dineína, que es 10 veces más grande que la de la cinesina, actúa como una máquina generadora de fuerza. Cada tallo contiene el importante sitio de unión con el microtúbulo situado en la punta. La proyección más larga, conocida como pie (o cola), vincula las cadenas intermedias y ligeras, cuyas funciones no están bien definidas. Análisis estructurales indican que el dominio motor de la dineína consiste en varios módulos distintos organizados en forma de rueda (véase fig. 9.37), lo cual lo hace fundamentalmente distinto de cinesina y miosina tanto en estructura como en modo de operación.
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Las pruebas de motilidad in vitro señalan que la dineína citoplásmica se mueve de manera progresiva a lo largo del microtúbulo hacia el extremo menos del polímero, contrario al sentido de la cinesina (fig. 9.17b). En todo el reino animal se identifica la dineína citoplásmica, pero al parecer no está presente en plantas superiores, que, según los expertos, tienen un conjunto más amplio de cinesinas dirigidas a un extremo menos (miembros de la cinesina-14). Se cuenta con evidencia que sugiere que la dineína citoplásmica tiene por lo menos dos funciones:
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Un agente generador de fuerza para el posicionamiento del huso y el movimiento de los cromosomas durante la mitosis (descrita en el capítulo 14).
Un motor microtubular dirigido al extremo menos para situar el centrosoma y el aparato de Golgi y para el movimiento de organelos, vesículas y partículas por el citoplasma.
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En las células nerviosas, se cree que la dineína citoplásmica participa en el movimiento retrógrado de organelos citoplásmicos y el movimiento anterógrado de los microtúbulos. En los fibroblastos y otras células no neurales, se supone que la dineína citoplásmica transporta organelos membranosos de sitios periféricos hacia el centro de la célula (fig. 9.17c). El cargamento impulsado por dineína incluye endosomas y lisosomas, vesículas derivadas del retículo endoplásmico en dirección al complejo de Golgi, moléculas de RNA y el virus VIH, que se transporta al núcleo de una célula infectada. La dineína citoplásmica no interactúa de modo directo con el cargamento limitado por la membrana, sino que necesita un adaptador con múltiples subunidades llamado dinactina. También es posible que la dinactina regule la actividad de la dineína y ayude a unir la proteína motora con el microtúbulo, lo cual incrementa la capacidad de proceso.
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De acuerdo con el modelo presentado en la figura 9.17c, que tal vez esté muy simplificado, la cinesina y la dineína citoplásmica mueven materiales similares en sentidos contrarios por la misma red de rieles. Como se indica en la figura 9.17b, los organelos individuales pueden unirse con cinesina y dineína al mismo tiempo, lo que otorga a estos organelos la capacidad de moverse en direcciones contrarias, según las condiciones. No hay certeza de la forma en que se regula la actividad de elementos motores contrarios, pero las observaciones in vitro han señalado que dos elementos motores contrarios pueden emprender una especie de “competencia extrema” al grado de que el objeto al cual están unidos se desplaza en forma oscilatoria hacia uno y otro bandos a lo largo del microtúbulo. Como se expone en la página 363, también puede haber miosina en algunos de los organelos mencionados, lo cual brinda la oportunidad de que éstos se desplacen a lo largo de los filamentos de actina y también de los microtúbulos.
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Centros organizadores de microtúbulos (MTOC, microtubule-organizing centers)
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La función de un microtúbulo dentro de una célula viva depende de su localización y orientación, lo que marca la importancia de comprender por qué un microtúbulo se ensambla en un sitio y no en otro. Cuando se estudia in vitro, el ensamble de microtúbulos a partir de los dímeros de tubulina alfa-beta ocurre en dos fases distintas: una fase lenta de nucleación, en la que al principio se forma una pequeña parte del microtúbulo y una fase mucho más rápida de elongación. A diferencia de lo que sucede in vitro, la nucleación de los microtúbulos es un fenómeno rápido dentro de la célula, donde ocurre en relación con diversas estructuras especializadas llamadas centros organizadores de microtúbulos (MTOC, microtubule-organizing centers). El MTOC mejor estudiado es el centrosoma.
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En las células animales, los microtúbulos del citoesqueleto casi siempre desarrollan el proceso de nucleación en el centrosoma, una estructura compleja que contiene dos centríolos con forma de barril rodeados por material pericentriolar (PCM) electrodenso (fig. 9.18a,b). Los centríolos son estructuras cilíndricas de unos 0.2 μm de diámetro y casi siempre miden lo doble de largo. Contienen nueve fibrillas espaciadas de manera uniforme; en el corte transversal cada una de ellas se ve como una banda de tres microtúbulos, designados túbulos A, B y C. Sólo el túbulo A es un microtúbulo completo (fig. 9.18a,b) y está conectado con el centro del centríolo mediante una estructura con disposición radial. Los tres microtúbulos de cada tripleta se disponen con un patrón que confiere al centríolo una apariencia característica de rueda de espigas. Por lo general los centríolos se encuentran en pares, con ambos elementos situados en ángulo recto entre sí (fig. 9.18a,c). La extracción de centrosomas aislados con yoduro de potasio 1.0 M retira cerca de 90% de la proteína del material pericentriolar y deja un andamiaje de fibras insolubles parecidas al espagueti (fig. 9.18d). Como se explica más adelante, el centrosoma es el principal sitio de inicio de los microtúbulos en las células animales y por lo general permanece en el centro de la red microtubular de la célula (fig. 9.18e).
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La figura 9.19a ilustra un experimento inicial que demuestra la participación del centrosoma en el inicio y la organización del citoesqueleto microtubular. Primero se despolimerizan los microtúbulos de una célula animal cultivada mediante la incubación de las células con colcemida, un fármaco que se une con las subunidades de tubulina y bloquea su utilización en la célula. El reensamble del microtúbulo se vigiló mediante eliminación del producto químico y tratando a las células fijadas, a distintos intervalos de tiempo con anticuerpos fluorescentes contra tubulina. Unos cuantos minutos después de la eliminación de las condiciones inhibidoras se observan una o dos manchas fluorescentes en el citoplasma de cada célula. Tras 15 a 30 min (fig. 9.19a), el número de filamentos marcados que irradian de estos focos aumenta en forma drástica. Cuando estas mismas células se cortan y examinan con un microscopio electrónico se ve que los microtúbulos recién formados irradian del centrosoma hacia fuera. Un examen más minucioso revela que en realidad los microtúbulos no penetran en el centrosoma ni hacen contacto con los centríolos, sino que terminan en el material pericentriolar denso que se encuentra en la periferia del centrosoma. Este material es el que inicia la formación de los microtúbulos (véase fig. 9.20c). Aunque los centríolos no participan de manera directa en la nucleación del microtúbulo, es probable que desempeñen una función en el reclutamiento de la materia pericentriolar durante el ensamble del centrosoma y en el proceso general de la duplicación del centrosoma (descrito en la sección 14.2).
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Según se ilustra con el experimento recién descrito, los centrosomas son los sitios de nucleación del microtúbulo. La polaridad de estos microtúbulos siempre es la misma: el extremo menos se asocia con el centrosoma y el extremo más (o creciente) se sitúa en la punta contraria (fig. 9.19b). Por ello, aunque los núcleos de los microtúbulos se formen en el MTOC, se alargan en el extremo contrario del polímero. El extremo creciente de un microtúbulo puede contener un conjunto de proteínas diferentes que ayudan a unir el microtúbulo con un objetivo particular, como un endosoma o cisterna de Golgi en una célula en interfase, o un cromosoma condensado en una célula en mitosis.
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La fracción de microtúbulos que permanecen asociados con el centrosoma varía mucho de un tipo celular a otro. El centrosoma de una célula no polarizada (p. ej., un fibroblasto) suele situarse cerca del centro de la célula y permanece vinculado con los extremos menos de una gran cantidad de microtúbulos (como en la figura 9.18e). En cambio, muchos de los microtúbulos de una célula epitelial polarizada se anclan por sus extremos menos en sitios dispersos cercanos al extremo apical de las células, ya que sus extremos más se dirigen hacia la superficie basal de la célula (fig. 9.1). Asimismo, el axón de una célula nerviosa contiene grandes cantidades de microtúbulos que no se asocian con el centrosoma, que se localiza en el cuerpo celular de la neurona. Se piensa que muchos de los microtúbulos axónicos se forman junto con el centrosoma, pero después son “separados” del MTOC y transportados dentro del axón por acción de proteínas motoras. Ciertas células animales, como los oocitos de los ratones, carecen de centrosomas y aún así son capaces de formar estructuras microtubulares complejas, como el huso meiótico (como se explica en el capítulo 14).
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Cuerpos basales y otros MTOC
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Los centrosomas no son los únicos MTOC de las células. Los microtúbulos externos de un cilio o flagelo se generan a partir de microtúbulos en una estructura llamada cuerpo basal, que se encuentra en la base del cilio o flagelo (véase fig. 9.33). Los cuerpos basales tienen una estructura idéntica a los centríolos; de hecho, los cuerpos basales y los centríolos pueden dar origen uno al otro. Por ejemplo, el cuerpo basal donde se origina el flagelo de un espermatozoide proviene de un centríolo que formó parte del huso meiótico del espermatocito del que proviene el espermatozoide. Por el contrario, el cuerpo basal del espermatozoide casi siempre se convierte en centríolo durante la primera división mitótica del huevo fertilizado. Las células vegetales carecen de centrosomas y centríolos, o cualquier otro tipo de MTOC evidente. En cambio, en una célula vegetal los microtúbulos están concentrados alrededor de la superficie del núcleo y dispersos en la corteza (fig. 9.22).
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Nucleación del microtúbulo
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Sin importar su apariencia tan diversa, todos los MTOC tienen funciones similares en todas las células; controlan el número de microtúbulos, su polaridad, el número de protofilamentos que constituyen sus paredes y el momento y la localización de su ensamble. Además, todos los MTOC comparten un componente proteínico, un tipo de tubulina descubierta a mediados del decenio de 1980 llamada tubulina gamma. A diferencia de las tubulinas alfa y beta que constituyen cerca de 2.5% de la proteína de una célula no neural, la tubulina gamma representa sólo 0.005% del total de proteínas de la célula. Los anticuerpos fluorescentes contra tubulina gamma tiñen todos los tipos de MTOC, inclusive el material pericentriolar de los centrosomas (fig. 9.20a), lo que sugiere que esta tubulina es un componente crucial en la nucleación de los microtúbulos. Esta conclusión se apoya con otros estudios. Por ejemplo, la microinyección de anticuerpos contra tubulina gamma en una célula viva bloquea el reensamble de microtúbulos después de su despolimerización mediante fármacos o frío.
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Para comprender el mecanismo de la nucleación de microtúbulos, los investigadores se enfocaron en la estructura y la composición del material pericentriolar (PCM) en la periferia de los centrosomas. Se cree que las fibras insolubles del PCM (fig. 9.18d) sirven como sitios de unión para las estructuras anulares que tienen el mismo diámetro que los microtúbulos (25 nm) y contienen tubulina gamma. Estas estructuras anulares se descubrieron cuando los centrosomas se purificaron e incubaron con anticuerpos marcados con oro que se unían con la tubulina gamma. Con el microscopio electrónico se observó que las partículas de oro se aglomeraban en semicírculos o anillos situados en los extremos menos de los microtúbulos (fig. 9.20b). Éstos son los extremos de los microtúbulos que están incluidos en el PCM del centrosoma donde la nucleación ocurre. Se aislaron complejos anulares similares de tubulina gamma (o γ-TuRC) de extractos celulares y se demostró que permiten la nucleación del ensamble de microtúbulos in vitro. Éstos y otros estudios sugieren el modelo que se muestra en la figura 9.20c en el que un conjunto helicoidal de subunidades de tubulina gamma (café) forman un molde anular sobre el que la primera hilera de dímeros de tubulina alfa-beta se ensambla. En este modelo sólo la tubulina alfa del heterodímero puede unirse con un anillo de subunidades gamma. Por lo tanto, el γ-TuRC determina la polaridad de todo el microtúbulo y también forma una capa en su extremo menos, que previene la ganancia o la pérdida de subunidades de tubulina.
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Las propiedades dinámicas de los microtúbulos
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Aunque todos los microtúbulos tienen una morfología muy similar, presentan diferencias marcadas en su estabilidad. Los microtúbulos se estabilizan por la presencia de MAP unidas (pág. 331) y tal vez también por otros factores que incluyen modificaciones postraduccionales a las subunidades de tubulina. Los microtúbulos del huso mitótico o del citoesqueleto son muy lábiles y esto significa que son sensibles para desarmarse. Los microtúbulos de las neuronas maduras son mucho menos lábiles y los de los centríolos, cilios y flagelos son muy estables. Las células vivas pueden someterse a diversos tratamientos que desarman los microtúbulos del citoesqueleto sin romper otras estructuras celulares. El desensamble puede inducirse con frío, presión hidrostática, aumento en la concentración de Ca2+ y diversos productos químicos, como la colchicina, vinblastina, vincristina, nocodazol y podofilotoxina. Los taxoles son fármacos que detienen las actividades dinámicas de los microtúbulos a través de un mecanismo muy diferente. El taxol se une con el polímero del microtúbulo, lo que inhibe su desensamble e impide que la célula ensamble las nuevas estructuras microtubulares necesarias. Muchos de estos compuestos, aun el taxol, se usan en la quimioterapia contra el cáncer porque destruyen las células tumorales en forma preferencial.
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La labilidad de los microtúbulos del citoesqueleto refleja el hecho de que son polímeros formados por enlace no covalente de bloques de construcción proteínicos. Por lo general los microtúbulos del citoesqueleto están sujetos a despolimerización y repolimerización conforme los requerimientos de la célula cambian de un momento a otro. El carácter dinámico del citoesqueleto microtubular está bien ilustrado en las células vegetales. Si una célula vegetal típica se vigila desde una división mitótica hasta la siguiente, aparecen cuatro conjuntos distintos de microtúbulos, uno después del otro (fig. 9.21).
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Durante la mayor parte de la interfase los microtúbulos de una célula vegetal se distribuyen por toda la corteza, como se muestra en la etapa 1 de la figura 9.21. Una búsqueda de la tubulina γ revela que este factor de nucleación se localiza a lo largo de los microtúbulos corticales, lo cual sugiere que los nuevos microtúbulos podrían formarse directamente en la superficie de los ya existentes. Esta idea es apoyada por estudios sobre la incorporación de tubulina en células vivas (fig. 9.22a) y por análisis in vitro (fig. 9.22b) que muestran microtúbulos recién formados de manera perpendicular a los lados de otros ya existentes. Una vez formados, es probable que los microtúbulos hijos se desprendan del progenitor y sean incorporados en los haces paralelos que circundan la célula (figs. 9.12a, 9.21).
Conforme la célula se aproxima a la mitosis, los microtúbulos desaparecen de la mayor parte de la corteza y dejan sólo una banda transversal llamada banda preprofase, que rodea la célula como un cinturón (paso 2, fig. 9.21). La banda preprofase marca el sitio del futuro plano de división.
A medida que la célula progresa hacia la mitosis, la banda preprofase se pierde y los microtúbulos reaparecen en la forma de huso mitótico (fig. 9.21, paso 3).
Después de que los cromosomas se separan, el huso mitótico desaparece y se sustituye por un haz de microtúbulos llamado fragmoplasto (fig. 9.21, paso 4), que desempeña una función central en la formación de la pared celular que separa las dos células hijas (véase fig. 14.38).
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Se cree que estos cambios drásticos en la organización espacial de los microtúbulos se logran mediante la combinación de dos mecanismos separados: (1) una nueva disposición de los microtúbulos existentes y (2) el desensamble de los microtúbulos existentes con un reensamble de otros nuevos en regiones distintas de la célula. En este último caso, los microtúbulos que constituyen la banda preprofase se forman a partir de las mismas subunidades que unos minutos antes eran parte de la matriz cortical o, antes que eso, del fragmoplasto.
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Bases de la dinámica de microtúbulos
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Los primeros datos sobre los factores que influyen en los índices de ensamble y desensamble del microtúbulo se obtuvieron de estudios in vitro. La primera estrategia exitosa respecto al ensamble de microtúbulos in vitro fue obra de Richard Weisenberg, de la Temple University, en 1972. Al razonar que los homogeneizados celulares deben tener todas las macromoléculas necesarias para el proceso de ensamble, Weisenberg logró la polimerización de tubulina en homogeneizados completos de cerebro a 37°C con la adición de Mg2+, GTP y EGTA (que se une con Ca2+, un inhibidor de la polimerización). Weisenberg encontró que los microtúbulos podrían desensamblarse y ensamblarse de nuevo una y otra vez con el solo descenso e incremento de la temperatura en la mezcla de incubación. La figura 9.23 muestra tres microtúbulos que se armaron en el tubo de ensayo a partir de tubulina purificada. Puede verse que uno de los tres microtúbulos contiene sólo 11 protofilamentos (como su diámetro menor lo indica). No resulta inesperado que los microtúbulos ensamblados in vitro tengan cantidades anormales de protofilamentos porque carecen del molde apropiado (fig. 9.20c) que en condiciones normales proporcionan los complejos anulares de tubulina gamma in vivo. El ensamble in vitro de microtúbulos se favorece mucho con la adición de MAP o con fragmentos de microtúbulos o estructuras que los contengan (fig. 9.24), que sirven como moldes para la adición de subunidades libres. En estos estudios in vitro se agregan subunidades de tubulina sobre todo al extremo más del polímero existente.
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Desde los primeros estudios in vitro se estableció que el ensamble de microtúbulos requiere GTP. El ensamble de dímeros de tubulina demanda la unión de una molécula de GTP con la subunidad de tubulina beta.3 Como al parecer resulta, finalmente la sup> Como al parecer resulta, finalmente laβ-tubulina no es sólo una proteína estructural, sino también una enzima, una GTPasa. La incorporación real del dímero al final de un microtúbulo no necesita hidrólisis de GTP, sino que el GTP se hidroliza poco después que el dímero se incorpora a un microtúbulo y el GDP resultante permanece unido con el polímero ensamblado. Luego que un dímero se libera de un microtúbulo durante el desensamble e ingresa a la reserva soluble, el GDP se sustituye con un GTP nuevo. Este intercambio de nucleótido “recarga” el dímero y permite que sirva de nuevo como bloque de construcción para la polimerización.
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Debido a que la hidrólisis del GTP incluye el ensamble de un microtúbulo, esta no es una actividad celular barata. ¿Por qué se desarrolló una vía de polimerización tan costosa? Para responder esta pregunta es conveniente considerar el efecto de la hidrólisis del GTP en la estructura del microtúbulo. Cuando un microtúbulo crece, el extremo más se ve al microscopio electrónico como una hoja abierta a la que se agregan dímeros-GTP (paso 1, fig. 9.25a, 9.25b). Durante las fases de crecimiento rápido del microtúbulo los dímeros de tubulina se agregan con más rapidez de lo que su GTP puede hidrolizarse. Se cree que la presencia de una capa de dímeros tubulina-GTP en los extremos más de los protofilamentos favorece la adición de más subunidades, con el crecimiento consecuente del microtúbulo. Sin embargo, se supone que los microtúbulos con extremos abiertos, como en el paso 1 de la figura 9.25a, experimentan una reacción espontánea que conduce al cierre del tubo (pasos 2 y 3). En este modelo el cierre del tubo se acompaña de hidrólisis del GTP unido, lo que genera subunidades que contienen tubulina unida con GDP. Las subunidades tubulina-GDP tienen una conformación distinta a sus precursores tubulina-GTP y son menos adecuadas para ajustarse en un protofilamento recto. La tensión mecánica resultante disminuye la estabilidad del microtúbulo. La energía de tensión se libera cuando los protofilamentos se curvan hacia afuera en el extremo más del túbulo y se someten a despolimerización catastrófica (fig. 9.25a, paso 4; fig. 9.25c). Por lo tanto, pareciera que la hidrólisis del GTP es un elemento fundamental de la calidad dinámica de los microtúbulos. La energía de tensión almacenada en un microtúbulo como resultado de la hidrólisis del GTP torna los microtúbulos inestables y capaces de desarmarse poco después de su formación (en ausencia de otros factores estabilizadores como las MAP). Los microtúbulos pueden encogerse con gran rapidez, sobre todo in vivo, lo que permite a la célula desarmar su citoesqueleto microtubular en muy poco tiempo.
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La microinyección de tubulina con marca fluorescente en una célula cultivada puede revelar el carácter dinámico del citoesqueleto microtubular dentro de una célula. Las subunidades marcadas se incorporan con rapidez en los microtúbulos preexistentes del citoesqueleto, aun en ausencia de cambios morfológicos (fig. 9.26). Si se observan microtúbulos individuales con el microscopio de fluorescencia, parecen crecer despacio por cierto periodo y luego se encogen con rapidez y en forma inesperada, como lo ilustra la vigilancia del microtúbulo de la figura 9.27. Puesto que el encogimiento ocurre de manera más rápida e inesperada que la elongación, la mayor parte de los microtúbulos desaparece de la célula en cuestión de minutos y se sustituye por microtúbulos nuevos que crecen a partir del centrosoma.
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En 1984, Timothy Mitchison y Marc Kirschner, de la University of California, San Francisco, informaron sobre las propiedades de los microtúbulos individuales y propusieron que el comportamiento del microtúbulo podía explicarse por un fenómeno denominado inestabilidad dinámica. La inestabilidad dinámica explica la observación de que (1) el crecimiento y reducción de microtúbulos pueden coexistir en la misma región de una célula y (2) que un microtúbulo determinado puede cambiar de manera impredecible (de manera fortuita) entre las fases de crecimiento y acortamiento, como en la figura 9.27. La inestabilidad dinámica es una propiedad inherente del microtúbulo y, más específicamente, del extremo más del microtúbulo. Como se indica en la figura 9.25, es el extremo más donde se agregan las subunidades durante el crecimiento y del que se pierden durante el acortamiento. Esto no significa que la inestabilidad dinámica no esté influida por factores externos. Por ejemplo, las células contienen un conjunto diverso de proteínas (llamadas +TIP) que se unen con los extremos más dinámicos de los microtúbulos. Algunas de estas +TIP regulan la velocidad de crecimiento o acortamiento del microtúbulo o la frecuencia de intercambio entre estas dos fases. Otras +TIP median la unión del extremo más del microtúbulo con una estructura celular específica, como el cinetocoro de un cromosoma mitótico durante la división celular, o el citoesqueleto de actina de la corteza durante el transporte en vesículas. Una vez que se une una estructura subcelular al extremo más de un microtúbulo, las propiedades dinámicas del microtúbulo pueden ejercer fuerza sobre la estructura. La polimerización de un microtúbulo puede desplazar un objeto unido, en sentido centrífugo, en tanto que la despolimerización de la misma estructura puede hacer que el objeto en cuestión se dirija en sentido centrípeto. Por ejemplo, este tipo de fuerzas de “arrastre” interviene decisivamente en la segregación de los cromosomas durante la división celular (sección 14.2).
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La inestabilidad dinámica constituye un mecanismo por medio del cual los extremos más de los microtúbulos pueden explorar rápidamente el citoplasma en busca de sitios de fijación apropiados. La fijación estabiliza temporalmente los microtúbulos y permite a la célula construir las complejas redes citoesqueléticas que se exponen en este capítulo. La inestabilidad dinámica también permite a las células reaccionar rápidamente a las condiciones cambiantes que requieren remodelación del citoesqueleto microtubular. Uno de los ejemplos más notables de tal remodelación se presenta en la mitosis, cuando los microtúbulos del citoesqueleto se desensamblan y remodelan en un huso mitótico bipolar. Esta reorganización se asocia con un intenso cambio en la estabilidad microtubular; los microtúbulos de las células en interfase tienen vidas medias cinco a 10 veces mayores que los de las células mitóticas. A diferencia de los microtúbulos del huso mitótico o el citoesqueleto, los de los organelos que se consideran a continuación carecen de actividad dinámica y son muy estables.
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Cilios y flagelos: estructura y función
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Cualquiera que haya colocado una gota de agua de un estanque bajo la lente del microscopio e intentado impedir que un protozoario nadara fuera del campo de visión puede apreciar la actividad de los cilios y los flagelos. Los cilios y los flagelos son organelos móviles similares a pelos que sobresalen de la superficie de diversas células eucariotas. Las bacterias también tienen estructuras conocidas como flagelos, pero los flagelos de los procariotas son filamentos simples sin relación evolutiva con sus contrapartes eucariotas (véase fig. 1.14). La explicación siguiente se refiere sólo a los organelos de células eucariotas.
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En esencia los cilios y los flagelos son la misma estructura. La mayoría de los biólogos usa uno u otro término con base en el tipo de célula del que el organelo se proyecta y su patrón de movimiento. De acuerdo con esta distinción, un cilio puede compararse con un remo que mueve la célula en sentido perpendicular al cilio mismo. Durante su desplazamiento el cilio se mantiene rígido (fig. 9.29a) mientras empuja contra el medio circundante. En su movimiento de recuperación el cilio se vuelve flexible y ofrece poca resistencia al medio. Los cilios tienden a encontrarse en grandes cantidades sobre la superficie celular y su actividad suele ser coordinada (fig. 9.29b). Los cilios mueven líquido y partículas a través de diversas vías en los organismos pluricelulares (fig. 9.29c). Por ejemplo, en los seres humanos el epitelio ciliado que recubre las vías respiratorias impulsa el moco y los detritos atrapados en él para alejarlos de los pulmones. No todos los cilios son móviles; muchas células del cuerpo tienen un solo cilio inmóvil (cilio primario) y se cree que desempeña una función sensorial al vigilar las propiedades de los líquidos extracelulares. Algunas de las funciones de los cilios únicos móviles e inmóviles se explican en la sección “Perspectiva humana”.
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Los flagelos se presentan en forma individual o en pares y tienen diversos patrones de movimiento (ondas), según el tipo celular. Por ejemplo, el alga unicelular que se presenta en la figura 9.30a se impulsa hacia el frente con las sacudidas de sus dos flagelos en forma asimétrica, semejante a la brazada de pecho de un nadador humano (fig. 9.30b). Esta misma alga puede empujarse a sí misma por el medio con un movimiento simétrico similar al del espermatozoide (mostrado en la figura 9.35). La concentración interna del ion de calcio regula el grado de asimetría del patrón de movimiento del alga.
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La micrografía electrónica de un corte transversal de un cilio o un flagelo es una de las imágenes más familiares de la biología celular (fig. 9.31a). Toda la proyección ciliar o flagelar está cubierta por una membrana que se continúa con la membrana plasmática de la célula. El centro del cilio, llamado axonema, contiene un conjunto de microtúbulos que corre en sentido longitudinal por todo el organelo. Con raras excepciones, el axonema de un cilio o flagelo móvil tiene nueve microtúbulos dobles periféricos que rodean un par central de microtúbulos. Esta misma estructura microtubular, que se conoce como “disposición 9 + 2”, se observa en los axonemas desde los protistas hasta los mamíferos y sirve como otro de los muchos recordatorios de que todas las células eucariotas vivas evolucionaron de un ancestro común. Todos los microtúbulos del axonema tienen la misma polaridad; sus extremos más se hallan en la punta de la proyección y los extremos menos, en la base. Cada pareja periférica consiste en un microtúbulo completo, el túbulo A, y un microtúbulo incompleto, el túbulo B; este último alberga 10 u 11 subunidades en lugar de las 13 usuales.
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La estructura básica del axonema se describió por primera vez en 1952; Irene Manton lo hizo en las plantas y Don Fawcett y Keith Porter, en células animales. (Los flagelos se perdieron durante la evolución de las plantas superiores.) Algunos de los componentes menos evidentes se hicieron visibles conforme el poder de resolución de los microscopios electrónicos mejoró (fig. 9.31b). Se observó que los túbulos centrales están rodeados por la vaina central, que está conectada con los túbulos A de los dobletes periféricos mediante un conjunto de estructuras radiales. Las parejas están conectadas entre sí por un puente entre parejas formado por una proteína elástica, la nexina. La observación de un par de “brazos” (un brazo interno y un brazo externo), que se proyectan del túbulo A (fig. 9.31a) fue muy importante. Un corte longitudinal, o sea, uno que pasa por el axonema paralelo a su eje longitudinal, revela la naturaleza continua de los microtúbulos y la naturaleza discontinua de los otros elementos (fig. 9.32a).
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Como se indicó antes, un cilio o flagelo surge de un cuerpo basal (fig. 9.33a) de estructura similar al centríolo de la figura 9.18a. Los túbulos A y B del cuerpo basal se elongan para formar las parejas del cilio o del flagelo (fig. 9.33b). Si un cilio o flagelo se arranca de la superficie de una célula viva, un nuevo organelo se regenera como excrecencia del cuerpo basal. Como sucede con otras estructuras microtubulares, el crecimiento de un axonema ocurre en los extremos más (externos) de sus microtúbulos. ¿Cómo es que una célula organiza y mantiene un sitio de construcción en la punta externa del axonema situado a micras del cuerpo de la célula donde la síntesis de los materiales de construcción tiene lugar?
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PERSPECTIVA HUMANA La función de los cilios en el desarrollo y la enfermedad
Cuando una persona se mira al espejo ve un organismo relativamente simétrico, uno cuya mitad izquierda es una imagen en espejo de la derecha. Por otra parte, los cirujanos ven organismos muy asimétricos cuando abren la cavidad torácica o abdominal de una persona. Por ejemplo, el estómago, el corazón y el bazo están desviados al lado izquierdo del cuerpo, mientras que el hígado se localiza en el lado derecho. En ocasiones algún médico encuentra un paciente en el que la asimetría entre los lados derecho e izquierdo de las vísceras está invertida (situación conocida como situs inversus).
El situs inversus se presenta en personas con el síndrome de Kartagener, que también se caracteriza por infecciones respiratorias y sinusales recurrentes e infertilidad en los varones. Los primeros indicios de la causa subyacente de este trastorno se obtuvieron en el decenio de 1970, cuando se descubrió que los espermatozoides inmóviles de estas personas tenían una estructura anormal del axonema. Según el paciente, los axonemas pueden carecer de las ramas externas o internas de dineína, de microtúbulos centrales o de las estructuras radiales (véase fig. 9.31). Estudios posteriores mostraron que este trastorno se debe a mutaciones en varios genes, inclusive los que codifican las cadenas pesadas e intermedias de dineína. Es comprensible que estas personas sufran infecciones respiratorias, lo que depende de la eliminación de detritos y bacterias por acción de los cilios del epitelio respiratorio, e infertilidad masculina, pero ¿por qué casi la mitad de ellos tiene inversión de la asimetría izquierda-derecha?
El plan corporal básico de un mamífero se establece durante la gastrulación gracias a una estructura llamada nodo embrionario. Cada célula que forma parte del nodo posee un solo cilio. Estos cilios tienen propiedades inusuales, carecen de los dos microtúbulos centrales (con una estructura axonémica 9 + 0) y tienen un movimiento rotatorio inusual (giratorio). Si la motilidad de estos cilios se altera, como sucede en los ratones con mutaciones en un gen de la dineína flagelar, casi la mitad de los animales presenta inversión de la asimetría, lo que sugiere que el azar determina la asimetría entre izquierda y derecha en estos mutantes.
La rotación de los cilios nodales mueve el líquido circundante al lado izquierdo de la línea media del embrión, como se demostró mediante el seguimiento del movimiento de cuentas fluorescentes microscópicas. Se propuso que el líquido extracelular movido por los cilios nodales contiene sustancias morfogenéticas (sustancias que dirigen el desarrollo embrionario) que se concentran al lado izquierdo del embrión, lo que conduce a la formación final de diferentes órganos a ambos lados de la línea media. Esta proposición se apoya en estudios experimentales en los que se desarrollaron embriones de ratones en cámaras miniaturizadas en las que podía imponerse un flujo artificial de líquido a través del nodo. Cuando los embriones se sometieron al flujo de líquido en dirección contraria a la que ocurre durante el desarrollo normal, los embriones desarrollaron inversión de la asimetría izquierda-derecha.a
Muchas células del cuerpo tienen un cilio primario único no móvil que carece de los microtúbulos y brazos de dineína. Durante años los investigadores ignoraron estos cilios, pero estudios recientes sugieren que desempeñan funciones importantes como “antenas” que perciben las propiedades químicas y mecánicas de los líquidos en los que se proyectan. Considérese el cilio primario (fig. 1) de las células epiteliales que recubren la luz de los túbulos renales microscópicos en los que se forma la orina. Se pudo advertir la importancia de tales estructuras cuando se descubrió que en la superficie de dichos cilios de riñones estaban un par de proteínas de membrana llamadas policistina 1 y 2 (PC1 y PC2) y una y otra proteína formaban un complejo en el cual PC1 actuaba como “sensor” del flujo de líquido dentro de los túbulos renales y PC2 actuaba como un canal de ion de calcio acompañante. Las mutaciones en PKD1 y PKD2, los genes que codifican PC1 y PC2, culminaban en la nefropatía poliquística en la cual aparecen en los riñones múltiples quistes que destruyen su función. Se piensa que la nefropatía poliquística es un cuadro patológico que es consecuencia de una “interrupción” o colapso de la regulación de la división celular porque los quistes son consecuencia de un nivel anormalmente grande de proliferación de las células epiteliales que revisten parte de los túbulos renales. Con arreglo a un modelo, las mutaciones en las policistinas alteran la respuesta de los cilios primarios al flujo de líquidos, con lo cual se perturba al flujo de calcio a través de la membrana cilial, situación que a la vez entorpece la transmisión de señales al cuerpo de la célula y el núcleo, y como consecuencia hay una proliferación celular anormal. El desplazamiento de los iones de calcio es tan sólo un tipo de señal que transmiten las membranas de los cilios primarios; este tipo de membrana ciliar de diferentes variedades de células contiene conjuntos particulares de proteínas que “captan” y reaccionan a diversas señales extracelulares. Las proteínas en cuestión desempeñan una actividad decisiva en el desarrollo embrionario y en la conservación de los tejidos sanos de adultos.
La importancia de los cilios en el desarrollo humano se ha hecho aún más evidente por la reciente revelación de que el síndrome de Bardet-Biedl (BBS) es causado por mutaciones en uno o varios genes que intervienen en el ensamblaje de cuerpos basales y cilios. Las personas afectadas por BBS tienen una variedad notable de anomalías que incluyen polidactilia (dedos adicionales en manos o pies), situs inversus, obesidad, enfermedad renal, defectos cardiacos, retraso mental, anomalías genitales, degeneración retiniana, pérdida auditiva y olfatoria, diabetes e hipertensión arterial. El hecho de que todas estas alteraciones puedan rastrearse hasta anomalías en cuerpos basales y cilios ilustra la importancia general de estas estructuras en el desarrollo y el funcionamiento de los órganos. Muchos de los genes implicados en estos diversos trastornos ciliares (“ciliopatías”) fueron identificados en organismos modelo como Chlamydomonas o C. elegans, lo cual constituye otro ejemplo de la importancia de la investigación básica en organismos no vertebrados para mejorar el conocimiento de la enfermedad humana.
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Transporte intraflagelar
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Aunque los biólogos han observado los flagelos de células vivas durante más de cien años, fue hasta 1993 que Joel Rosembaum y colaboradores, de Yale University, vieron el movimiento de las partículas en el espacio entre las parejas periféricas y la membrana plasmática circundante del flagelo. Estudios posteriores revelaron un proceso conocido como transporte intraflagelar (IFT, intraflagellar transport), que se encarga de ensamblar y mantener estos organelos. El IFT depende del movimiento dirigido hacia ambos extremos, más y menos, a lo largo de los microtúbulos (fig. 9.34). La cinesina-2 mueve matricies complejas de partículas junto con materiales de construcción, a lo largo de protofilamentos de las parejas periféricas hasta el sitio de ensamble en la punta del axonema en crecimiento. Las moléculas de cinesina-2 (y las proteínas axonémicas recicladas) se transportan de nuevo al cuerpo basal por los mismos microtúbulos flagelares mediante un mecanismo impulsado por dineína citoplásmica. Estudios recientes también implicaron a IFT en el transporte de varias moléculas de señalización importantes. Varios de los rasgos característicos del síndrome de Bardet-Biedl, incluidos la obesidad y los dedos supernumerarios, pueden rastrearse hasta trastornos en el transporte de moléculas de señalización.
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Los brazos de dineína
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La maquinaria para la locomoción ciliar y flagelar se encuentra dentro del axonema. Esto se ilustra en el experimento mostrado en la figura 9.35, en la que el axonema de la cola de un espermatozoide, carente de la membrana que lo cubre, aún es capaz de efectuar movimientos sostenidos y normales en presencia de Mg2+ y ATP agregados. A mayor concentración de ATP, mayor frecuencia de los movimientos de estos organelos “reactivados”.
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Ian Gibbons, de la Harvard University, aisló la proteína que se encarga de la conversión de la energía química del ATP en energía mecánica de locomoción ciliar en el decenio de 1960. Los experimentos de Gibbons brindan un ejemplo elegante de la relación entre la estructura y la función en los sistemas biológicos y los medios por los que la relación puede revelarse mediante el análisis experimental. Gibbons utilizó varias soluciones capaces de disolver distintos componentes y realizó la disección química de los cilios del protozoario Tetrahymena (fig. 9.36). En el paso 1 se muestra el corte transversal de un cilio intacto. La disección comenzó con la solubilización de la membrana plasmática en el detergente digitonina (paso 2). Los axonemas aislados de la fracción insoluble se sumergieron en una solución con EDTA, un compuesto que une iones divalentes y los retira (por quelación). Cuando los axonemas tratados con EDTA se examinaron bajo el microscopio electrónico, los túbulos centrales no estaban, lo mismo que los brazos que sobresalen de los túbulos A (paso 3). De manera simultánea con la pérdida de estas estructuras, los axonemas insolubles perdieron su capacidad para hidrolizar ATP, propiedad que el sobrenadante ganó. La ATPasa encontrada en el sobrenadante era una proteína enorme (de hasta 2 millones de Da) que Gibbons denominó dineína (de las palabras dyne, que significa “fuerza” y proteína). Esta proteína ahora se conoce como dineína ciliar (o axonémica) para distinguirla de la dineína citoplásmica, una proteína relacionada que participa en el transporte de organelos y partículas. Cuando las partes insolubles del axonema se mezclaron con la proteína soluble en presencia de Mg2+, gran parte de la actividad de la ATPasa se vinculó de nuevo con el material insoluble en la mezcla (paso 4). El examen de la fracción insoluble mostró que los brazos habían reaparecido en los túbulos A de los axonemas. Gibbons concluyó que los brazos vistos en las micrografías eran equivalentes a las moléculas de ATPasa de dineína recuperadas en la solución con EDTA, por lo que eran los brazos los que liberaban la energía necesaria para la locomoción.
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En investigaciones posteriores se observó que el tratamiento de axonemas aislados de espermatozoides con solución hipertónica (0.6 M de NaCl) eliminaba en forma selectiva los brazos externos y dejaba los internos en su sitio (paso 5). Cuando se agregaba ATP a los axonemas que carecían de los brazos externos, éstos se movían a la mitad de la velocidad del axonema intacto, aunque realizaron el movimiento en forma de onda normal.
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La figura 9.37a muestra una micrografía electrónica de la molécula de dineína externa (dineína del brazo externo) del axonema de Tetrahymena. Esta molécula de dineína consiste en tres cadenas pesadas y varias cadenas intermedias y ligeras. Como se describe en la página 337, cada cadena pesada de dineína está formada por un pie largo, una cabeza con forma de rueda y un tallo. La figura 9.37b,c presenta micrografías electrónicas de alta resolución de cadenas pesadas individuales de dineína de flagelos de Chlamydomonas preparados en dos condiciones distintas. Se propone que la diferencia en la conformación entre las moléculas de estas dos micrografías (mostradas unidas en la fig. 9.37d) representa la aplicación de energía cinética de la dineína, una proteína motora flagelar. En este modelo, la rotación de la cabeza mostrada en la figura 9.37b′,c′ sirve como fuerza impulsora básica para los movimientos ciliar y flagelar. Para comprender el mecanismo que permite este tipo de movilidad hay que reconsiderar la estructura del axonema.
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El mecanismo de locomoción ciliar y flagelar
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Como se explica más adelante en este capítulo, la contracción del músculo se debe al deslizamiento de los filamentos de actina sobre los filamentos adyacentes de miosina. La fuerza de deslizamiento se genera en los enlaces cruzados semejantes a trinquetes que se encuentran en la cabeza de la molécula de miosina. Con el sistema muscular como modelo, se propuso que el movimiento ciliar podía explicarse por el deslizamiento de parejas de microtúbulos adyacentes entre sí. De acuerdo con esta idea, los brazos de dineína mostrados en la figura 9.37 actúan como puentes colgantes que generan las fuerzas necesarias para el movimiento ciliar o flagelar. La figura 9.38 presenta la secuencia de estos acontecimientos.
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En el axonema intacto, el tallo de cada molécula de dineína (con sus cadenas intermedias y ligeras asociadas) está anclado con firmeza a la superficie del túbulo A, con las cabezas globulares y los tallos proyectados hacia el túbulo B de la pareja vecina. En el paso 1 de la figura 9.38, los brazos de dineína anclados en el túbulo A de la pareja inferior se adhieren a los sitios de unión del túbulo B de la pareja superior. En el paso 2, las moléculas de dineína experimentan un cambio en la conformación, o aplicación de energía, que ocasiona el deslizamiento de la pareja inferior hacia el extremo basal de la pareja superior. Este cambio en la conformación de la cadena pesada de dineína se muestra en la figura 9.37b-d. En el paso 3 de la figura 9.38, los brazos de dineína se desprendieron del túbulo B del doblete superior. En el paso 4, los brazos se unieron de nuevo a la pareja superior para iniciar un nuevo ciclo. (La figura 18.18 presenta una micrografía electrónica del corte transversal a través del cilio con los brazos de dineína de una pareja unidos a la pareja adyacente.)
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La nexina es una proteína elástica que conecta los dobletes adyacentes (fig. 9.31). Estos puentes de nexina tienen una función importante en el movimiento ciliar y flagelar porque limitan la distancia de deslizamiento de los dobletes adyacentes uno sobre otro. La resistencia al deslizamiento que ejercen los puentes de nexina hace que el axonema se doble como respuesta a la fuerza de deslizamiento. El deslizamiento de un lado del axonema se alterna con el deslizamiento del otro lado, de manera que una parte del cilio o flagelo se flexiona primero en una dirección y luego en la dirección contraria (fig. 9.39). Para esto es necesario que, en un momento determinado, los brazos de dineína de un lado del axonema estén activos, en tanto que los del otro lado están inactivos. Como resultado de esta diferencia en la actividad de la dineína, las parejas del lado interno del doblez (correspondientes a las partes superior e inferior de la figura 9.39) se extienden más allá que las del lado contrario del axonema.
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Se acumula evidencia constante en favor de la teoría del microtúbulo deslizante y de la función de los brazos de dineína. El deslizamiento del microtúbulo en los axonemas flagelares en movimiento se observó ya en forma directa, como lo ilustran las fotografías de la figura 9.40. En este experimento los axonemas aislados se incubaron con cuentas diminutas de oro que se unieron a la superficie externa expuesta de las parejas periféricas. Las cuentas sirvieron como marcadores fijos de sitios específicos en las parejas. Luego se vigiló la posición relativa de las cuentas mientras los axonemas se estimularon para moverse con la adición de ATP. Conforme los axonemas se doblaron a uno y otro lado, la distancia entre las cuentas de las distintas parejas aumentó y disminuyó en forma alternada (fig. 9.40), como era de esperarse si las parejas vecinas se deslizaran de ida y vuelta una sobre la otra.
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REVISIÓN
Describir tres funciones de los microtúbulos.
Contrastar las funciones aparentes de la cinesina y la dineína citoplásmica en el transporte axónico.
¿Qué es un centro organizador de microtúbulos (MTOC)? Describir la estructura de tres MTOC diferentes y cómo funciona cada uno de ellos.
¿Qué función desempeña el GTP en el ensamble de los microtúbulos? ¿Qué significa el término “inestabilidad dinámica”? ¿Qué función cumple en la actividad celular?
Contrastar los movimientos de un flagelo y un cilio. Describir el pulso de energía de una cadena pesada de la dineína. Describir el mecanismo por el que los cilios y los flagelos son capaces de efectuar sus movimientos de flexión.
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