Capítulo 9: El citoesqueleto y la movilidad celular

El esqueleto de un vertebrado es un sistema orgánico familiar que consiste en elementos endurecidos que sostienen los tejidos blandos del cuerpo y desempeñan una función clave en los movimientos corporales. Las células eucariotas también poseen un “sistema esquelético”, un citoesqueleto, que tiene funciones análogas. El citoesqueleto se compone de tres estructuras filamentosas bien definidas, microtúbulos, microfilamentos y filamentos intermedios, que en conjunto constituyen una red interactiva. Cada uno de los tres tipos de filamentos citoesqueléticos es un polímero de subunidades proteínicas unidas mediante enlaces débiles no covalentes. Este tipo de construcción se presta a un ensamble y un desensamble rápidos, que dependen de una regulación celular compleja. Cada elemento del citoesqueleto tiene propiedades distintas. Los microtúbulos son tubos largos, huecos y sin ramificaciones compuestos por subunidades de la proteína tubulina. Los microfilamentos son estructuras sólidas más delgadas, a menudo organizadas en una red ramificada y formados por la proteína actina. Los filamentos intermedios son fibras resistentes, similares a cuerdas, formadas por diversas proteínas relacionadas. En el cuadro 9.1 se resumen las propiedades de los microtúbulos, filamentos intermedios y filamentos de actina. Aunque los componentes del citoesqueleto parecen estacionarios en las micrografías, en realidad son estructuras muy dinámicas capaces de reorganizarse en forma drástica. Durante muchos años se aceptó ampliamente que el citoesqueleto era estrictamente una innovación eucariótica que no tenían las células procarióticas. Se sabe hoy día que innumerables procariotas contienen proteínas similares a la tubulina y la actina que se polimerizan en filamentos citoplásmicos y que desempeñan actividades similares a las del citoesqueleto. También se han descubierto en determinados procariotas que existen proteínas lejanamente relacionadas con las de los filamentos intermedios, por lo cual parecería que los tres tipos de elementos del citoesqueleto tienen sus raíces evolutivas en estructuras procariotas. El capítulo comienza con una breve revisión de las principales actividades citoesqueléticas.

La figura 9.1 presenta una revisión de las principales actividades del citoesqueleto en tres diferentes células no musculares. Las células que se muestran en esta ilustración esquemática incluyen una célula epitelial polarizada, la punta de una célula nerviosa en proceso de alargamiento y una célula cultivada en fase de división. Como se explica en este capítulo, el citoesqueleto de estas células funciona como:

1. Un andamio dinámico que brinda soporte estructural, el cual puede determinar la forma de la célula y resistir fuerzas que tiendan a deformarla.

2. Un marco interno encargado de establecer las posiciones de los organelos dentro de la célula. Esta función resulta muy evidente en las células epiteliales polarizadas, como las que se muestran en la figura 8.11, en las que ciertos organelos están dispuestos en un orden definido del extremo apical de la célula a la parte basal.

3. Una red de rieles que dirigen el movimiento de materiales y organelos dentro de las células. Los ejemplos de esta función comprenden el traslado de las moléculas de mRNA a partes específicas de una célula, el movimiento de portadores membranosos del retículo endoplásmico al aparato de Golgi y el transporte de vesículas que contienen neurotransmisores a lo largo de la célula nerviosa. La figura 9.2 muestra una pequeña porción de una célula cultivada y es evidente que la mayor parte de los organelos verdes fluorescentes, que son peroxisomas (pág. 206), se asocia con los microtúbulos (rojos) del citoesqueleto celular. Los microtúbulos son los rieles sobre los que los peroxisomas se transportan en las células de los mamíferos.

4. El aparato generador de fuerza que mueve las células de un sitio a otro. Los organismos unicelulares se mueven por “arrastramiento” sobre la superficie de un sustrato sólido o al propulsarse por su ambiente acuoso con la ayuda de organelos locomotores especializados que contienen microtúbulos (cilios y flagelos) que sobresalen de la superficie celular. Los animales tienen diversas células con capacidad de locomoción independiente, como los espermatozoides, los leucocitos y los fibroblastos (fig. 9.3). La punta de un axón en crecimiento también tiene una gran movilidad (fig. 9.1) y su movimiento se parece al de una célula que “se arrastra”.

5. Un componente esencial de la maquinaria para la división celular. Los elementos del citoesqueleto constituyen el aparato que se encarga de separar los cromosomas durante la mitosis y la meiosis, además de dividir la célula madre en dos células hijas durante la citocinesis. Estos fenómenos se describen con detalle en el capítulo 14.

El citoesqueleto es uno de los temas que se estudian de manera más activa en la biología celular actual debido, en parte, al desarrollo de técnicas que permiten a los investigadores buscar una estrategia morfológica, bioquímica y molecular coordinada. Como resultado, se sabe mucho de las familias de proteínas que conforman el citoesqueleto; cómo se organizan las subunidades en sus estructuras fibrosas respectivas; los “motores” moleculares que mueven estos filamentos y generan las fuerzas necesarias para las actividades motrices y las características dinámicas que controlan la organización espacial, el ensamble y el desensamble de los diversos elementos del citoesqueleto. A continuación se presenta una breve revisión de unas cuantas de las estrategias más importantes para el estudio del citoesqueleto.

Uso de microscopia de fluorescencia en células vivas

El concepto de que las células eucariotas contenían una red de elementos de citoesqueleto surgió de estudios de cortes hísticos con el microscopio electrónico en los decenios de 1950 y 1960. Sin embargo, el microscopio electrónico sólo produce imágenes estáticas y no brinda mucha información respecto a la estructura dinámica y la función de los diversos componentes del citoesqueleto. La apreciación del carácter dinámico del citoesqueleto avanzó mucho durante los últimos decenios como resultado de una revolución en la microscopia óptica. El microscopio de fluorescencia (sección 18.1) tiene una participación preponderante en esta revolución al permitir a los investigadores observar en forma directa los procesos moleculares en las células vivas, un método que se conoce como visualización de células vivas.

En la técnica más usual se sintetizan proteínas con marcas fluorescentes dentro de una célula como una proteína fusionada que contiene proteína verde fluorescente (GFP). Esta técnica se describió en el capítulo anterior (pág. 273) y en la figura 9.2 se muestra un ejemplo. En una técnica alternativa las subunidades proteínicas de las estructuras del citoesqueleto (p. ej., tubulina o queratina purificadas) se marcan con fluorescencia in vitro mediante enlace covalente con un colorante fluorescente pequeño. Las subunidades marcadas se aplican luego por microinyección en una célula viva, donde se incorporan en la forma polimérica de la proteína, como un microtúbulo o un filamento intermedio. El comportamiento dinámico de la estructura fluorescente puede seguirse en el tiempo conforme la célula realiza sus actividades normales. La figura 9.4 muestra los cambios drásticos en la longitud y la orientación de los microtúbulos individuales en el borde de avance de una célula que se inyectó con tubulina marcada con un producto fluorescente.

Si se inyectan cantidades muy pequeñas de proteína con marca fluorescente, los filamentos del citoesqueleto ya no se marcan de manera uniforme como en la figura 9.4, sino que contienen pocas manchas fluorescentes a espacios irregulares. Estas manchas sirven como marcadores fijos para seguir los cambios dinámicos en la longitud y la orientación del filamento. La figura 9.27 es un ejemplo de esta técnica, que se conoce como microscopia de partículas con fluorescencia.

La microscopia de fluorescencia también puede usarse para revelar la localización de una proteína en concentraciones muy bajas dentro de la célula. Este tipo de experimento se realiza mejor con anticuerpos marcados con fluorescencia que se unen con gran afinidad a la proteína que se busca. Los anticuerpos son muy útiles porque se distinguen entre variantes muy similares (isomorfas) de una proteína. La proteína puede localizarse mediante la inyección del anticuerpo marcado en una célula viva, lo que también revela la función de la proteína estudiada porque la unión del anticuerpo casi siempre elimina la capacidad de la proteína para efectuar su actividad normal. Una alternativa consiste en identificar la localización de la proteína estudiada con la adición del anticuerpo fluorescente a células fijas o cortes hísticos, como se ilustra en la figura 9.5.

El uso de pruebas de moléculas individuales in vitro e in vivo

Las imágenes digitales capturadas con las cámaras de video modernas tienen un contraste excepcional y pueden intensificarse mediante el procesamiento de la imagen por computadora. Estas características permiten observar y fotografiar elementos que son invisibles con el microscopio óptico, como los microtúbulos de 25 nm o las vesículas de membrana de 40 nm. El advenimiento de la videomicroscopia de alta resolución dio lugar al desarrollo de pruebas de motilidad in vitro. Estas pruebas hacen posible la detección de la actividad de una molécula proteínica individual que actúa como motor molecular en “tiempo real.”¹ Por ejemplo, las técnicas cuantitativas monomoleculares han permitido a los investigadores seguir la “sucesión” de fenómenos que acaecen cuando una molécula motora se desplaza por su trayectoria. Las observaciones en cuestión no fueron posibles con las técnicas bioquímicas corrientes que promedian resultados obtenidos de un gran número de moléculas. En algunas de las pruebas iniciales, los microtúbulos estaban unidos a un portaobjetos. Después, cuentas microscópicas que contienen proteínas motoras unidas se colocan justo sobre los microtúbulos mediante rayos láser dirigidos. Los rayos láser pasan a través de la lente del objetivo de un microscopio y ello produce una fuerza de atracción débil cerca del punto focal. Como puede sujetar objetos microscópicos, a este aparato se le conoce como pinzas ópticas. Cuando existe ATP como fuente energética, es posible registrar los movimientos de una cuenta a lo largo de un microtúbulo con una cámara de video, lo que revela el tamaño de los pasos individuales que da la proteína motora. También pueden usarse rayos láser dirigidos para “atrapar” una sola cuenta y determinar las fuerzas diminutas (medidas en unos cuantos piconewtons, pN) que genera una sola proteína motora en su “intento” por mover la cuenta contra la fuerza ejercida por la trampa óptica (en la figura 11.5 se ilustra este tipo de experimento).

Aunque los experimentos de trampa óptica hacen posible detectar la movilidad de las proteínas motoras in vitro, estas mediciones son indirectas porque los investigadores vigilan el desplazamiento de las cuentas, no de las moléculas proteínicas. Al combinar la microscopia de fluorescencia con técnicas especializadas de imágenes, los científicos han podido visualizar en forma directa el movimiento de las moléculas motoras individuales, tanto in vitro como en células vivas. Los ejemplos de esta estrategia experimental se ilustran en la figura 9.6. Para la prueba in vitro, el gen para el motor cinesina se fusiona con GFP (como se explica en la sección 18.1), el gen fusionado se introduce en células cultivadas y permite que éstas produzcan la proteína cinesina marcada, que luego se purifica. Este procedimiento permitió a los investigadores obtener moléculas motoras fluorescentes verdes. Mientras tanto, el equipo preparó microtúbulos marcados con un colorante fluorescente rojo. Cuando se combinaron estas dos preparaciones en las condiciones apropiadas, los investigadores pudieron seguir los movimientos de una molécula de cinesina individual marcada con GFP a lo largo de un solo microtúbulo, como se ve en los cuadros sucesivos de la figura 9.6a. Es posible obtener imágenes claras porque se usa un tipo especializado de microscopia de fluorescencia basada en láser llamada TIRF (total internal reflection microscopy), que permite al observador enfocarse en un plano muy delgado que está justo sobre la superficie en la que se encuentran los microtúbulos. Como resultado, los haces de luz fluorescente de otras áreas del campo de visión no ocultan la información que surge de las moléculas individuales de proteínas cuyas actividades se vigilan. Con este método experimental, los científicos pueden comparar las propiedades de distintas proteínas motoras, medir las propiedades de motores individuales en distintas condiciones experimentales o investigar cómo una mutación específica de una proteína motora afecta sus propiedades de motilidad.

Con una tecnología similar, los investigadores han podido visualizar el movimiento de las cinesinas individuales dentro de células vivas. La figura 9.6c muestra un ejemplo de este tipo de experimento. Para realizarlo, se modifica el genoma de las células a fin de que sinteticen polímeros de microtúbulo con marca fluorescente y moléculas de cinesina con marca fluorescente. Así, los investigadores pueden observar la interacción de los dos tipos de proteínas marcadas cuando ocurre dentro del citoplasma celular. Como en los experimentos in vitro, se sigue el movimiento de las moléculas de cinesina-GFP individuales mediante microscopia TIRF. Juntas, estas técnicas permiten a los investigadores una revisión detallada de las proteínas motoras en acción.

Las técnicas de fluorescencia con microscopio corriente permiten a los investigadores vigilar los movimientos de moléculas de proteínas individuales, pero por sí mismas no consiguen la resolución de tales moléculas. En consecuencia, con las técnicas ópticas en cuestión es muy difícil conocer los mecanismos moleculares gracias a los cuales actúan las proteínas en cuestión. Por otra parte, las técnicas de microscopia electrónica y cristalografía de rayos X son perfectamente adecuadas para conocer en detalle la estructura de las moléculas, aunque sólo aportan “imágenes” fugitivas de la molécula en una sola fase de su actividad. En los últimos años surgió una técnica nueva con la cual se obtiene la alta resolución de la microscopia electrónica y la posibilidad de observar un proceso ininterrumpido en tiempo real; utiliza el microscopio de fuerza atómica (AFM, atomic force microscope; sección 18.3), instrumento que utiliza un extremo nanométrico para sondear la superficie de una muestra macromolecular. El uso de AFM para detectar los movimientos de una sola proteína motora se presenta en las imágenes de la figura 9.52.

El AFM se ha utilizado también para medir las propiedades mecánicas de los elementos del citoesqueleto. Un grupo de investigadores encontró que es posible incrustar la punta de un AFM en un filamento intermedio individual y jalar el extremo o la porción media del filamento para probar su extensibilidad y fuerza tensil. La figura 9.7 muestra los resultados de un experimento así en el que una sección corta de un filamento intermedio inmovilizado se jala de su conformación lineal. En estos experimentos se demostró que un segmento del filamento puede estirarse por medios mecánicos hasta 3.5 veces su longitud normal antes que se rompa en dos. Estos resultados confirman la sugerencia de que los filamentos intermedios son mucho más extensibles que los microfilamentos o los microtúbulos.

El desarrollo de técnicas para trabajar con moléculas aisladas coincidió con la creación de un nuevo campo de la ingeniería mecánica llamado nanotecnología. La meta de los nanotecnólogos es la creación de “nanomáquinas” diminutas (de 10 a 100 nm de tamaño) capaces de desempeñar actividades específicas en un mundo submicroscópico. Las nanomáquinas tienen muchos usos potenciales, inclusive en la medicina. Se supone que estas máquinas podrán introducirse en el cuerpo humano para realizar alguna tarea específica, como el hallazgo y la destrucción de células cancerosas individuales. Mientras esto ocurre, la naturaleza ya desarrolló nanomáquinas, entre ellas las proteínas motoras que se describen en este capítulo. No es sorprendente que varios laboratorios de nanotecnología hayan empezado a usar estos “camiones” nanométricos para mover cargas moleculares, distintas a cualquiera que haya en organismos vivos.

Uso de técnicas de imágenes de fluorescencia para vigilar la dinámica del citoesqueleto

Dentro de las células vivas, los microtúbulos y los filamentos de actina del citoesqueleto son sistemas poliméricos muy dinámicos. La palabra “dinámico” se usa con frecuencia en esta obra y vale la pena considerar las implicaciones del término. Para un biólogo celular, “dinámico” implica “en constante cambio”. Las estructuras dinámicas experimentan algún tipo de reconstrucción todo el tiempo, ya sea que sus partes antiguas se intercambien por nuevas o que se degraden por completo y se reconstruyan. Por lo tanto, aunque un microtúbulo o filamento de actina parezca estático de un momento al otro si se observa al microscopio, en realidad sus componentes moleculares se encuentran en un estado de cambio constante. La célula regula las propiedades dinámicas de estas estructuras, que pueden cambiar de un sitio del citoplasma a otro, o en momentos distintos durante el ciclo celular. La vigilancia de estos cambios requiere el uso de técnicas capaces de medir la dinámica de polímeros. Una técnica poderosa llamada recuperación de fluorescencia después de fotoblanqueamiento (o FRAP) ya se comentó antes al describir el movimiento de las proteínas de membrana (pág. 142). En esta sección se revisa su aplicación al estudio de las propiedades dinámicas de los microtúbulos. Para realizar un experimento de FRAP, una célula se inyecta con tubulina marcada con un colorante fluorescente o se induce para que exprese tubulina-GFP. Con un microscopio equipado con un láser capaz de enfocarse en una pequeña región de la célula, se blanquea la fluorescencia de la tubulina en esa región con un rayo láser. Después es posible vigilar la preparación a lo largo del tiempo y medir la recuperación de la señal fluorescente en la zona blanqueada (fig. 9.8a,c). Como ocurre con la mayor parte de los métodos usados en la biología celular y molecular, a menudo hay varias interpretaciones posibles del resultado de un experimento. Por ejemplo, la recuperación de la fluorescencia puede ser el resultado del recambio dinámico de los microtúbulos en la zona blanqueada, del crecimiento de nuevos microtúbulos en esa zona o del desplazamiento de los microtúbulos a través de la zona blanqueada (fig. 9.8b). En general, se necesitan más experimentos para distinguir entre estas posibles explicaciones.

Estructura y composición

Como su nombre lo indica, los microtúbulos son estructuras tubulares huecas y se encuentran en casi todas las células eucariotas. Los microtúbulos forman parte de diversas estructuras, como el huso mitótico de las células en división y el centro de cilios y flagelos. Los microtúbulos tienen un diámetro externo de 25 nm, una pared con grosor aproximado de 4 nm y pueden extenderse a lo largo o ancho de la célula. La pared de un microtúbulo está formada por proteínas globulares dispuestas en hileras longitudinales, conocidas como protofilamentos, que se alinean en paralelo con respecto al eje longitudinal del túbulo (fig. 9.9a). Cuando se observan en un corte transversal, puede verse que los microtúbulos están formados por 13 protofilamentos alineados lado a lado en un círculo dentro de la pared (fig. 9.9b). Se cree que las interacciones no covalentes entre protofilamentos adyacentes tienen una función importante para mantener la estructura del microtúbulo.

Cada protofilamento se ensambla a partir de bloques diméricos de construcción consistentes en una subunidad tubulina alfa y una tubulina beta. Los dos tipos de subunidades de tubulina tienen una estructura tridimensional similar y se acomodan con fuerza como se muestra en la figura 9.9c. Los dímeros de tubulina se organizan en un patrón lineal a lo largo de cada protofilamento, observándose esto en la figura 9.9d. Ya que cada unidad de ensamble contiene dos componentes no idénticos (un heterodímero), el protofilamento es asimétrico, con una tubulina alfa en un extremo y una tubulina beta en el otro. Todos los protofilamentos de un microtúbulo poseen la misma polaridad. Por consiguiente, todo el polímero tiene la misma polaridad. Un extremo del microtúbulo se conoce como el extremo más y termina con una fila de subunidades beta (fig. 9.9d). El extremo contrario es el extremo menos y concluye con una fila de subunidades de tubulina alfa. Como se explica más adelante en el capítulo, la polaridad estructural de los microtúbulos es un factor importante en el crecimiento de estas estructuras y su capacidad para participar en actividades mecánicas dirigidas.

Proteínas asociadas con los microtúbulos

Por lo general los microtúbulos preparados a partir de tejido vivo contienen proteínas adicionales, llamadas proteínas asociadas con microtúbulos (MAP, microtubule-associated proteins). Las MAP comprenden un conjunto heterogéneo de proteínas. Las primeras MAP que se identificaron se conocen como “MAP clásicas” y casi siempre tienen un dominio que se une con la parte lateral de un microtúbulo y otro dominio que se proyecta hacia fuera como filamento desde la superficie del microtúbulo. La figura 9.10 muestra la unión de estas MAP con la superficie del microtúbulo. Algunas MAP pueden verse en micrografías electrónicas como puentes que conectan los microtúbulos entre sí, lo que mantiene su alineación paralela. Las MAP suelen incrementar la estabilidad de los microtúbulos y promover su ensamble. La actividad de unión con microtúbulos de las diversas MAP se controla sobre todo con la adición y el retiro de grupos fosfato de residuos de aminoácidos particulares. Un nivel demasiado alto de fosforilación de una MAP particular llamada tau se implicó en el desarrollo de varios trastornos neurodegenerativos letales, incluida la enfermedad de Alzheimer (pág. 67). Las células cerebrales de las personas con estas enfermedades contienen filamentos extraños y enredados (marañas neurofibrilares) formados por moléculas tau con fosforilación excesiva e incapaces de unirse con los microtúbulos. Al parecer, los filamentos neurofibrilares contribuyen a la muerte de las células nerviosas. Las personas con una de estas enfermedades, la demencia hereditaria FTDP-17, tienen mutaciones en el gen tau, lo que indica que la alteración de la proteína tau es la causa primaria de este trastorno.

Microtúbulos como soportes y organizadores estructurales

Los microtúbulos son lo bastante rígidos para resistir fuerzas que pudieran comprimir o doblar la fibra. Esta propiedad les permite brindar soporte mecánico, tal como las vigas de acero sostienen un edificio alto de oficinas o los postes que sostienen la estructura de una tienda. La distribución de los microtúbulos citoplásmicos en una célula ayuda a determinar la forma de la misma. En células animales cultivadas, los microtúbulos se extienden con un patrón radial desde el área alrededor del núcleo hacia la periferia, lo que confiere su forma redondeada y aplanada a estas células (fig. 9.11). En cambio, los microtúbulos de las células epiteliales cilíndricas casi siempre están orientados con el eje longitudinal paralelo al eje mayor de la célula (fig. 9.1a). Esta configuración sugiere que los microtúbulos ayudan a mantener la forma alargada de la célula. La función de los microtúbulos como elementos esqueléticos es evidente en ciertos procesos celulares muy alargados, como los cilios y los flagelos, o los axones de las neuronas.

En las células vegetales los microtúbulos desempeñan una función indirecta en el mantenimiento de la forma celular mediante su influencia en la formación de la pared celular. Durante la interfase, la mayor parte de los microtúbulos de una célula vegetal se localiza justo debajo de la membrana plasmática (como en la figura 9.9b) y forma una zona cortical distintiva. Se cree que los microtúbulos de la corteza influyen en el movimiento de las enzimas que sintetizan celulosa y que se localizan en la membrana plasmática (véase fig. 7.37). Como resultado las microfibrillas de celulosa de la pared celular se ensamblan con una orientación paralela a los microtúbulos subyacentes de la corteza (fig. 9.12). La orientación de estas microfibrillas de celulosa tiene una participación importante en la determinación de las características de crecimiento de la célula y, por lo tanto, en su forma. En casi todas las células las microfibrillas de celulosa recién sintetizadas y los microtúbulos alineados se disponen en dirección perpendicular con el eje longitudinal de la célula (transversal), como aros alrededor de un barril (fig. 9.12). Como las microfibrillas de celulosa resisten la expansión natural, la presión de turgencia que ejerce el líquido en la vacuola celular se dirige a los extremos de la célula, lo que produce su elongación.

También se cree que los microtúbulos participan en el mantenimiento de la organización interna de las células. El tratamiento de las células con agentes que desorganizan los microtúbulos puede afectar mucho la localización de organelos membranosos, inclusive el retículo endoplásmico y el aparato de Golgi. De forma típica, el complejo de Golgi está organizado como una sola “franja” situada cerca del centro de las células de mamíferos (consúltese la fig. 8.20c), exactamente a un lado del núcleo. El tratamiento de las células con nocodazol o con colchicina que “desorganizan” los microtúbulos, separará los elementos del sistema de Golgi en “cúmulos” dispersos en todo el citoplasma. Las membranas del aparato de Golgi regresan a su posición normal en el interior de la célula cuando el fármaco se retira y los microtúbulos se reensamblan.

Microtúbulos como agentes de movilidad intracelular

Las células vivas están repletas de actividad, mientras las macromoléculas y los organelos se mueven de manera dirigida de un sitio a otro. Aunque todo este ajetreo puede apreciarse al observar el movimiento de materiales específicos en una célula viva, los procesos subyacentes suelen ser difíciles de estudiar porque la mayor parte de las células carece de un citoesqueleto muy ordenado. Por ejemplo, se sabe que el transporte de materiales de un compartimiento de membrana a otro depende de la presencia de microtúbulos, porque la interrupción específica de estos elementos citoesqueléticos detiene los movimientos. El estudio de la movilidad intracelular se iniciará con las células nerviosas, cuyos movimientos intracelulares dependen de un conjunto muy organizado de microtúbulos y otros filamentos del citoesqueleto.

Transporte axónico

El axón de una neurona motora individual puede prolongarse desde la médula espinal hasta la punta de un dedo de la mano o del pie. El centro de manufactura de esta neurona es su cuerpo celular, una porción redondeada de la célula que se encuentra dentro de la médula espinal. Cuando se inyectan aminoácidos marcados en el cuerpo celular, se incorporan a proteínas marcadas que se mueven hacia el axón y viajan por toda su extensión. Muchos materiales distintos, entre ellos moléculas neurotransmisoras, se incluyen en los compartimientos dentro de vesículas membranosas en el retículo endoplásmico y el aparato de Golgi del cuerpo celular y luego se transportan por toda la longitud del axón (fig. 9.13a). Los cargamentos que no se unen a membranas, como el RNA, los ribosomas y elementos del citoesqueleto, también se transportan por esta vasta extensión de citoplasma alargado. Los diferentes materiales se mueven a distintos ritmos y el transporte axónico más rápido alcanza velocidades de 5 μm por segundo. A este ritmo, una vesícula sináptica jalada por proteínas motoras de dimensiones nanométricas pueden viajar 40 cm en un solo día, o casi la mitad de la distancia entre la médula espinal y la punta de un dedo. Se dice que las estructuras y los materiales que viajan desde el cuerpo celular hasta las terminaciones de una neurona se mueven en dirección anterógrada. Otras estructuras, como las vesículas endocíticas que se forman en las terminaciones nerviosas y transportan factores desde las células blanco, se mueven en dirección contraria, o retrógrada: desde la sinapsis hacia el cuerpo celular. Los defectos en el transporte anterógrado y retrógrado se han vinculado con varias afecciones neurológicas.

Los axones están llenos de estructuras del citoesqueleto, inclusive haces de microfilamentos, filamentos intermedios y microtúbulos interconectados de varias maneras (fig. 9.13b,c). Con la videomicroscopia, los investigadores pueden seguir vesículas individuales mientras se mueven a lo largo de los microtúbulos de un axón, ya sea hacia el cuerpo celular o en sentido contrario (fig. 9.14). Estos movimientos son mediados principalmente por microtúbulos (fig. 9.13c), que sirven como vías para diversas proteínas motoras que generan las fuerzas necesarias a fin de mover objetos dentro de una célula. El estudio de las proteínas motoras es un tema central de la biología celular y molecular; se cuenta con mucha información de la naturaleza de estas moléculas, así como de su mecanismo de acción, que son los temas de la sección siguiente.

Proteínas motoras que cruzan el citoesqueleto microtubular

Las proteínas motoras de una célula convierten la energía química (almacenada en forma de ATP) en energía mecánica, que se emplea para mover el cargamento celular unido al motor. Los tipos de cargamento celular que estas proteínas transportan comprenden vesículas, mitocondrias, lisosomas, cromosomas y otros filamentos del citoesqueleto. Una sola célula puede contener cien proteínas motoras diferentes, cada una supuestamente especializada en una actividad distinta, como el movimiento de tipos particulares de cargamento en una región específica de la célula. En conjunto, las proteínas motoras pueden agruparse en tres grandes familias: cinesinas, dineínas y miosinas. Las cinesinas y las dineínas se mueven a lo largo de los microtúbulos, en tanto que las miosinas lo hacen a lo largo de microfilamentos. No se conoce ningún motor proteínico que utilice los filamentos intermedios como rieles. Esto no resulta sorprendente si se considera que los filamentos intermedios no están polarizados y por lo tanto, no proporcionan señales direccionales al motor.

Las proteínas motoras se mueven por pasos en una sola dirección a lo largo del riel de citoesqueleto, de un sitio de unión al siguiente. Conforme la proteína avanza, experimenta varios cambios en la conformación que constituyen un ciclo mecánico. Los pasos del ciclo mecánico se coordinan con los pasos de un ciclo químico (o catalítico), el cual proporciona la energía necesaria para impulsar la actividad del motor (véase la figura 9.61 para un ejemplo). Los pasos del ciclo químico abarcan la unión de una molécula de ATP con el motor, la hidrólisis de ATP, la liberación de los productos (ADP y Pi) del motor y la unión de una nueva molécula de ATP. La unión e hidrólisis de una sola molécula de ATP en el sitio catalítico se emplea para generar un pulso de energía que mueve el motor un número preciso de nanómetros sobre el riel. Conforme la proteína motora se mueve a los sitios sucesivos sobre el polímero del citoesqueleto, los ciclos mecánico y químico se repiten una y otra vez, lo que tira del cargamento distancias considerables. Hay que tener presente que se trata de motores de tamaño molecular que, a diferencia de las máquinas hechas por el hombre, dependen mucho de su ambiente. Por ejemplo, las proteínas motoras no tienen momento y están sujetas a una resistencia por fricción enorme por su ambiente viscoso. Como resultado, una proteína motora se detiene casi de inmediato una vez que el aporte de energía cesa.

Se iniciará con la revisión de la estructura molecular y las funciones de las cinesinas, las más pequeñas y mejor comprendidas de los motores microtubulares.

Cinesinas

En 1985, Ronald Vale y colaboradores aislaron una proteína motora del citoplasma de los axones de calamar gigante que usaban los microtúbulos como rieles. Esta proteína se denominó cinesina y luego se encontró en casi todas las células eucariotas. La molécula de cinesina descubierta en 1985, a la que se ha llamado “cinesina corriente” o cinesina-1, es un miembro de una superfamilia de proteínas similares llamadas proteínas relacionadas con cinesina (KRP, kinesin-related proteins), y se clasifican en 14 familias (de la cinesina-1 a la 14). En los comentarios que haremos el uso del término cinesina, lo aplicaremos sólo a miembros de la familia de cinesina-1.

Cada molécula de cinesina-1 es un tetrámero compuesto de dos cadenas pesadas idénticas y otras dos ligeras también idénticas (fig. 9.15a). Una molécula de cinesina tiene varias partes, incluido un par de cabezas globulares que se unen a un microtúbulo y actúan como “máquinas” generadoras de fuerza que hidrolizan ATP. Cada cabeza (o dominio motor) se conecta con un cuello, un pedúnculo cilíndrico y una cola con forma de abanico que se une al cargamento que debe moverse (fig. 9.15a). Los segmentos motores de todas las KRP tienen secuencias similares de aminoácidos, lo cual refleja su origen evolutivo común y su actuación similar para desplazarse sobre los microtúbulos. A diferencia de ello, los segmentos caudales de KRP tienen secuencias diferentes que reflejan la variedad de “cargamentos” que acarrean tales elementos motores. Se han identificado proteínas diferentes como posibles adaptadoras que vinculan KRP específicas y el “cargamento”. Algo sorprendente es que el dominio motor de la cinesina tiene una estructura muy similar a la de la miosina, a pesar del hecho de que las cinesinas son proteínas mucho más pequeñas y los dos tipos de motores operan en rieles distintos. Es casi seguro que la cinesina y la miosina evolucionaron de una proteína ancestral común presente en alguna célula eucariota primitiva.

Cuando se observan las moléculas de cinesina purificada en una prueba de motilidad in vitro, las proteínas motoras se mueven a lo largo de microtúbulos hacia su extremo más (fig. 9.6). Por lo tanto, se dice que la cinesina es un motor microtubular dirigido al lado más. En un axón, donde todos los microtúbulos están orientados con su extremo menos (–) hacia el cuerpo celular, la cinesina transporta vesículas y otros cargamentos hacia las terminaciones sinápticas. El descubrimiento de la cinesina se comenta en “Vías experimentales”, que se puede encontrar en la red en la liga www.wiley.com/college/karp.

Una sola molécula de cinesina se mueve sobre un solo protofilamento de un microtúbulo a una velocidad proporcional a la concentración de ATP (hasta una velocidad máxima de 1 μm por segundo). Cuando las concentraciones de ATP son bajas, las moléculas de cinesina se desplazan con suficiente lentitud para que los observadores concluyan que la proteína se mueve por pasos (fig. 9.15b). Cada paso es de unos 8 nm de largo, que también es la longitud de un dímero de tubulina en un protofilamento y requiere la hidrólisis de una sola molécula de ATP. En la actualidad se acepta de manera general que la cinesina se mueve por un mecanismo “mano sobre mano” que se muestra en la figura 9.15b. Conforme a este modelo, que es básicamente similar a una persona que sube por una cuerda, las dos cabezas se alternan para tomar la primera o la segunda posiciones sin una rotación acompañante del tallo y la carga en cada paso.

El movimiento de las moléculas de cinesina, tanto in vitro como in vivo, es muy progresivo, lo que significa que la proteína motora tiende a moverse a lo largo de un microtúbulo individual por distancias considerables (más de 1 μm) sin desprenderse. Una molécula de cinesina de dos cabezas puede lograr esta hazaña porque una de las cabezas está unida con el microtúbulo en todo momento (fig. 9.15b). Una proteína motora con esta capacidad está bien adaptada para el transporte independiente y por largas distancias de pequeños paquetes de cargamento.

Las dos cabezas de la molécula de la cinesina funcionan en forma coordinada, de modo que siempre están en diferentes etapas de sus ciclos químico y mecánico en cualquier momento dado. Cuando una cabeza se une al microtúbulo, los cambios resultantes de conformación en la región del cuello adyacente de la proteína motora hacen que la otra cabeza se mueva hacia adelante al siguiente sitio de unión en el profilamento. Es probable que la cabeza con desplazamiento anterógrado encuentre su sitio de unión preciso en el protofilamento mediante una búsqueda aleatoria rápida. Estas actividades se ilustran en la figura 9.15c, que presenta las porciones de la cabeza y cuello de la cadena pesada de una cinesina monomérica unida a un microtúbulo. La actividad catalítica de la cabeza produce un movimiento de balanceo del cuello, que en esta ilustración está unido con una molécula de GFP (la proteína verde con forma de barril) y no con el tallo y la cabeza de la segunda cinesina en el dímero. El microtúbulo no es una vía pasiva donde se tienen estos eventos, sino que tiene un papel activo para estimular ciertos pasos de los ciclos mecánico y químico de la molécula de cinesina. Las cinesinas solubles libres adoptan una conformación plegada autoinhibida que necesita interactuar con el cargamento y un microtúbulo, para activarse.

Como la cinesina-1, la mayor parte de las KLP se mueve hacia el extremo más del microtúbulo al que están unidas. Sin embargo, una pequeña familia (llamada cinesina 14), que incluye la ampliamente estudiada proteína Ncd de Drosophila, se mueve en sentido contrario, esto es, al extremo menos del riel microtubular. Aunque podría esperarse que las cabezas de las KRP dirigidas al extremo más y las dirigidas al extremo menos tuvieran estructuras diferentes porque contienen los dominios motores catalíticos, las cabezas de los dos tipos de proteínas son indistinguibles. En lugar de eso, la discrepancia en la dirección del movimiento se rastreó hasta las diferencias en las regiones adyacentes del cuello de las dos proteínas. Cuando la cabeza de una molécula Ncd dirigida al extremo menos se une con el cuello y el tallo de una molécula de cinesina, la proteína híbrida se mueve hacia el extremo más del riel. Por lo tanto, aunque la híbrida tiene un dominio catalítico que en condiciones normales se movería hacia el extremo menos de un microtúbulo, siempre que esté unido al cuello de un motor hacia el extremo más, se mueve en esta última dirección.

Una tercera familia pequeña (cinesina-13) de proteínas similares a la cinesina, es incapaz de moverse. Las KRP de este grupo se unen a cualquier extremo de un microtúbulo y causan su despolimerización en vez de moverse por él. Estas proteínas a menudo se denominan despolimerasas de microtúbulos.² El importante cometido de éstas y otras KRP durante la división celular se revisa en el capítulo 14.

Transporte de organelos mediado por cinesina En el capítulo 8 se describió cómo se mueven las vesículas de un compartimiento membranoso, como el aparato de Golgi, a otro, como un lisosoma. Los trayectos que las vesículas citoplásmicas y los organelos siguen están definidos por los microtúbulos (véase fig. 9.1); los integrantes de la superfamilia de la cinesina tienen una participación muy importante como agentes generadores de fuerza que impulsa el movimiento de este cargamento limitado por membrana. En la mayor parte de las células, como en los axones, los microtúbulos se alinean con sus extremos más apuntando lejos del centro de la célula. Por lo tanto, los miembros de la superfamilia de cinesina tienden a mover vesículas y organelos (p. ej., peroxisomas y mitocondrias) hacia el exterior, a la membrana plasmática celular. Lo anterior se ilustra en las micrografías de la figura 9.16. El par de micrografías de la izquierda muestra una célula aislada de un embrión normal con 9.5 días de desarrollo que se tiñó para revelar la localización de sus microtúbulos (verde) y mitocondrias (naranja). El par de micrografías de la derecha muestra una célula que se aisló de un embrión de ratón con 9.5 días de desarrollo, pero que carece de ambas copias del gen que codifica la cadena pesada KIF5B de la cinesina. Las mitocondrias de la célula deficiente en KIF5B están ausentes en las regiones periféricas de la célula, como se esperaría si esta cinesina dirigida al extremo más afuera es la encargada del movimiento centrífugo de los organelos membranosos (véase también fig. 9.17c).

Dineína citoplásmica

El primer motor asociado a los microtúbulos se descubrió en 1963 como la proteína encargada del movimiento de cilios y flagelos. Esta proteína se denominó dineína. Aunque casi de inmediato se sospechó la existencia de formas citoplásmicas, pasaron 20 años antes que una proteína similar se purificara e identificara en el tejido cerebral de los mamíferos a la que se llamó dineína citoplásmica. Si bien el ser humano tiene muchas cinesinas (y miosinas) diferentes, cada una adaptada para funciones específicas, puede funcionar con sólo dos dineínas citoplásmicas, una de las cuales parece ser responsable de la mayor parte de las operaciones de transporte.

La dineína citoplásmica es una proteína enorme (su masa molecular se aproxima a 1.5 millones de Da) formada por dos cadenas pesadas idénticas y varias cadenas intermedias y ligeras (fig. 9.17a). Cada cadena pesada de la dineína consiste en una cabeza globular grande con dos proyecciones alargadas (tallos). La cabeza de la dineína, que es 10 veces más grande que la de la cinesina, actúa como una máquina generadora de fuerza. Cada tallo contiene el importante sitio de unión con el microtúbulo situado en la punta. La proyección más larga, conocida como pie (o cola), vincula las cadenas intermedias y ligeras, cuyas funciones no están bien definidas. Análisis estructurales indican que el dominio motor de la dineína consiste en varios módulos distintos organizados en forma de rueda (véase fig. 9.37), lo cual lo hace fundamentalmente distinto de cinesina y miosina tanto en estructura como en modo de operación.

Las pruebas de motilidad in vitro señalan que la dineína citoplásmica se mueve de manera progresiva a lo largo del microtúbulo hacia el extremo menos del polímero, contrario al sentido de la cinesina (fig. 9.17b). En todo el reino animal se identifica la dineína citoplásmica, pero al parecer no está presente en plantas superiores, que, según los expertos, tienen un conjunto más amplio de cinesinas dirigidas a un extremo menos (miembros de la cinesina-14). Se cuenta con evidencia que sugiere que la dineína citoplásmica tiene por lo menos dos funciones:

1. Un agente generador de fuerza para el posicionamiento del huso y el movimiento de los cromosomas durante la mitosis (descrita en el capítulo 14).

2. Un motor microtubular dirigido al extremo menos para situar el centrosoma y el aparato de Golgi y para el movimiento de organelos, vesículas y partículas por el citoplasma.

En las células nerviosas, se cree que la dineína citoplásmica participa en el movimiento retrógrado de organelos citoplásmicos y el movimiento anterógrado de los microtúbulos. En los fibroblastos y otras células no neurales, se supone que la dineína citoplásmica transporta organelos membranosos de sitios periféricos hacia el centro de la célula (fig. 9.17c). El cargamento impulsado por dineína incluye endosomas y lisosomas, vesículas derivadas del retículo endoplásmico en dirección al complejo de Golgi, moléculas de RNA y el virus VIH, que se transporta al núcleo de una célula infectada. La dineína citoplásmica no interactúa de modo directo con el cargamento limitado por la membrana, sino que necesita un adaptador con múltiples subunidades llamado dinactina. También es posible que la dinactina regule la actividad de la dineína y ayude a unir la proteína motora con el microtúbulo, lo cual incrementa la capacidad de proceso.

De acuerdo con el modelo presentado en la figura 9.17c, que tal vez esté muy simplificado, la cinesina y la dineína citoplásmica mueven materiales similares en sentidos contrarios por la misma red de rieles. Como se indica en la figura 9.17b, los organelos individuales pueden unirse con cinesina y dineína al mismo tiempo, lo que otorga a estos organelos la capacidad de moverse en direcciones contrarias, según las condiciones. No hay certeza de la forma en que se regula la actividad de elementos motores contrarios, pero las observaciones in vitro han señalado que dos elementos motores contrarios pueden emprender una especie de “competencia extrema” al grado de que el objeto al cual están unidos se desplaza en forma oscilatoria hacia uno y otro bandos a lo largo del microtúbulo. Como se expone en la página 363, también puede haber miosina en algunos de los organelos mencionados, lo cual brinda la oportunidad de que éstos se desplacen a lo largo de los filamentos de actina y también de los microtúbulos.

Centros organizadores de microtúbulos (MTOC, microtubule-organizing centers)

La función de un microtúbulo dentro de una célula viva depende de su localización y orientación, lo que marca la importancia de comprender por qué un microtúbulo se ensambla en un sitio y no en otro. Cuando se estudia in vitro, el ensamble de microtúbulos a partir de los dímeros de tubulina alfa-beta ocurre en dos fases distintas: una fase lenta de nucleación, en la que al principio se forma una pequeña parte del microtúbulo y una fase mucho más rápida de elongación. A diferencia de lo que sucede in vitro, la nucleación de los microtúbulos es un fenómeno rápido dentro de la célula, donde ocurre en relación con diversas estructuras especializadas llamadas centros organizadores de microtúbulos (MTOC, microtubule-organizing centers). El MTOC mejor estudiado es el centrosoma.

Centrosomas

En las células animales, los microtúbulos del citoesqueleto casi siempre desarrollan el proceso de nucleación en el centrosoma, una estructura compleja que contiene dos centríolos con forma de barril rodeados por material pericentriolar (PCM) electrodenso (fig. 9.18a,b). Los centríolos son estructuras cilíndricas de unos 0.2 μm de diámetro y casi siempre miden lo doble de largo. Contienen nueve fibrillas espaciadas de manera uniforme; en el corte transversal cada una de ellas se ve como una banda de tres microtúbulos, designados túbulos A, B y C. Sólo el túbulo A es un microtúbulo completo (fig. 9.18a,b) y está conectado con el centro del centríolo mediante una estructura con disposición radial. Los tres microtúbulos de cada tripleta se disponen con un patrón que confiere al centríolo una apariencia característica de rueda de espigas. Por lo general los centríolos se encuentran en pares, con ambos elementos situados en ángulo recto entre sí (fig. 9.18a,c). La extracción de centrosomas aislados con yoduro de potasio 1.0 M retira cerca de 90% de la proteína del material pericentriolar y deja un andamiaje de fibras insolubles parecidas al espagueti (fig. 9.18d). Como se explica más adelante, el centrosoma es el principal sitio de inicio de los microtúbulos en las células animales y por lo general permanece en el centro de la red microtubular de la célula (fig. 9.18e).

La figura 9.19a ilustra un experimento inicial que demuestra la participación del centrosoma en el inicio y la organización del citoesqueleto microtubular. Primero se despolimerizan los microtúbulos de una célula animal cultivada mediante la incubación de las células con colcemida, un fármaco que se une con las subunidades de tubulina y bloquea su utilización en la célula. El reensamble del microtúbulo se vigiló mediante eliminación del producto químico y tratando a las células fijadas, a distintos intervalos de tiempo con anticuerpos fluorescentes contra tubulina. Unos cuantos minutos después de la eliminación de las condiciones inhibidoras se observan una o dos manchas fluorescentes en el citoplasma de cada célula. Tras 15 a 30 min (fig. 9.19a), el número de filamentos marcados que irradian de estos focos aumenta en forma drástica. Cuando estas mismas células se cortan y examinan con un microscopio electrónico se ve que los microtúbulos recién formados irradian del centrosoma hacia fuera. Un examen más minucioso revela que en realidad los microtúbulos no penetran en el centrosoma ni hacen contacto con los centríolos, sino que terminan en el material pericentriolar denso que se encuentra en la periferia del centrosoma. Este material es el que inicia la formación de los microtúbulos (véase fig. 9.20c). Aunque los centríolos no participan de manera directa en la nucleación del microtúbulo, es probable que desempeñen una función en el reclutamiento de la materia pericentriolar durante el ensamble del centrosoma y en el proceso general de la duplicación del centrosoma (descrito en la sección 14.2).

Según se ilustra con el experimento recién descrito, los centrosomas son los sitios de nucleación del microtúbulo. La polaridad de estos microtúbulos siempre es la misma: el extremo menos se asocia con el centrosoma y el extremo más (o creciente) se sitúa en la punta contraria (fig. 9.19b). Por ello, aunque los núcleos de los microtúbulos se formen en el MTOC, se alargan en el extremo contrario del polímero. El extremo creciente de un microtúbulo puede contener un conjunto de proteínas diferentes que ayudan a unir el microtúbulo con un objetivo particular, como un endosoma o cisterna de Golgi en una célula en interfase, o un cromosoma condensado en una célula en mitosis.

La fracción de microtúbulos que permanecen asociados con el centrosoma varía mucho de un tipo celular a otro. El centrosoma de una célula no polarizada (p. ej., un fibroblasto) suele situarse cerca del centro de la célula y permanece vinculado con los extremos menos de una gran cantidad de microtúbulos (como en la figura 9.18e). En cambio, muchos de los microtúbulos de una célula epitelial polarizada se anclan por sus extremos menos en sitios dispersos cercanos al extremo apical de las células, ya que sus extremos más se dirigen hacia la superficie basal de la célula (fig. 9.1). Asimismo, el axón de una célula nerviosa contiene grandes cantidades de microtúbulos que no se asocian con el centrosoma, que se localiza en el cuerpo celular de la neurona. Se piensa que muchos de los microtúbulos axónicos se forman junto con el centrosoma, pero después son “separados” del MTOC y transportados dentro del axón por acción de proteínas motoras. Ciertas células animales, como los oocitos de los ratones, carecen de centrosomas y aún así son capaces de formar estructuras microtubulares complejas, como el huso meiótico (como se explica en el capítulo 14).

Cuerpos basales y otros MTOC

Los centrosomas no son los únicos MTOC de las células. Los microtúbulos externos de un cilio o flagelo se generan a partir de microtúbulos en una estructura llamada cuerpo basal, que se encuentra en la base del cilio o flagelo (véase fig. 9.33). Los cuerpos basales tienen una estructura idéntica a los centríolos; de hecho, los cuerpos basales y los centríolos pueden dar origen uno al otro. Por ejemplo, el cuerpo basal donde se origina el flagelo de un espermatozoide proviene de un centríolo que formó parte del huso meiótico del espermatocito del que proviene el espermatozoide. Por el contrario, el cuerpo basal del espermatozoide casi siempre se convierte en centríolo durante la primera división mitótica del huevo fertilizado. Las células vegetales carecen de centrosomas y centríolos, o cualquier otro tipo de MTOC evidente. En cambio, en una célula vegetal los microtúbulos están concentrados alrededor de la superficie del núcleo y dispersos en la corteza (fig. 9.22).

Nucleación del microtúbulo

Sin importar su apariencia tan diversa, todos los MTOC tienen funciones similares en todas las células; controlan el número de microtúbulos, su polaridad, el número de protofilamentos que constituyen sus paredes y el momento y la localización de su ensamble. Además, todos los MTOC comparten un componente proteínico, un tipo de tubulina descubierta a mediados del decenio de 1980 llamada tubulina gamma. A diferencia de las tubulinas alfa y beta que constituyen cerca de 2.5% de la proteína de una célula no neural, la tubulina gamma representa sólo 0.005% del total de proteínas de la célula. Los anticuerpos fluorescentes contra tubulina gamma tiñen todos los tipos de MTOC, inclusive el material pericentriolar de los centrosomas (fig. 9.20a), lo que sugiere que esta tubulina es un componente crucial en la nucleación de los microtúbulos. Esta conclusión se apoya con otros estudios. Por ejemplo, la microinyección de anticuerpos contra tubulina gamma en una célula viva bloquea el reensamble de microtúbulos después de su despolimerización mediante fármacos o frío.

Para comprender el mecanismo de la nucleación de microtúbulos, los investigadores se enfocaron en la estructura y la composición del material pericentriolar (PCM) en la periferia de los centrosomas. Se cree que las fibras insolubles del PCM (fig. 9.18d) sirven como sitios de unión para las estructuras anulares que tienen el mismo diámetro que los microtúbulos (25 nm) y contienen tubulina gamma. Estas estructuras anulares se descubrieron cuando los centrosomas se purificaron e incubaron con anticuerpos marcados con oro que se unían con la tubulina gamma. Con el microscopio electrónico se observó que las partículas de oro se aglomeraban en semicírculos o anillos situados en los extremos menos de los microtúbulos (fig. 9.20b). Éstos son los extremos de los microtúbulos que están incluidos en el PCM del centrosoma donde la nucleación ocurre. Se aislaron complejos anulares similares de tubulina gamma (o γ-TuRC) de extractos celulares y se demostró que permiten la nucleación del ensamble de microtúbulos in vitro. Éstos y otros estudios sugieren el modelo que se muestra en la figura 9.20c en el que un conjunto helicoidal de subunidades de tubulina gamma (café) forman un molde anular sobre el que la primera hilera de dímeros de tubulina alfa-beta se ensambla. En este modelo sólo la tubulina alfa del heterodímero puede unirse con un anillo de subunidades gamma. Por lo tanto, el γ-TuRC determina la polaridad de todo el microtúbulo y también forma una capa en su extremo menos, que previene la ganancia o la pérdida de subunidades de tubulina.

Las propiedades dinámicas de los microtúbulos

Aunque todos los microtúbulos tienen una morfología muy similar, presentan diferencias marcadas en su estabilidad. Los microtúbulos se estabilizan por la presencia de MAP unidas (pág. 331) y tal vez también por otros factores que incluyen modificaciones postraduccionales a las subunidades de tubulina. Los microtúbulos del huso mitótico o del citoesqueleto son muy lábiles y esto significa que son sensibles para desarmarse. Los microtúbulos de las neuronas maduras son mucho menos lábiles y los de los centríolos, cilios y flagelos son muy estables. Las células vivas pueden someterse a diversos tratamientos que desarman los microtúbulos del citoesqueleto sin romper otras estructuras celulares. El desensamble puede inducirse con frío, presión hidrostática, aumento en la concentración de Ca²⁺ y diversos productos químicos, como la colchicina, vinblastina, vincristina, nocodazol y podofilotoxina. Los taxoles son fármacos que detienen las actividades dinámicas de los microtúbulos a través de un mecanismo muy diferente. El taxol se une con el polímero del microtúbulo, lo que inhibe su desensamble e impide que la célula ensamble las nuevas estructuras microtubulares necesarias. Muchos de estos compuestos, aun el taxol, se usan en la quimioterapia contra el cáncer porque destruyen las células tumorales en forma preferencial.

La labilidad de los microtúbulos del citoesqueleto refleja el hecho de que son polímeros formados por enlace no covalente de bloques de construcción proteínicos. Por lo general los microtúbulos del citoesqueleto están sujetos a despolimerización y repolimerización conforme los requerimientos de la célula cambian de un momento a otro. El carácter dinámico del citoesqueleto microtubular está bien ilustrado en las células vegetales. Si una célula vegetal típica se vigila desde una división mitótica hasta la siguiente, aparecen cuatro conjuntos distintos de microtúbulos, uno después del otro (fig. 9.21).

1. Durante la mayor parte de la interfase los microtúbulos de una célula vegetal se distribuyen por toda la corteza, como se muestra en la etapa 1 de la figura 9.21. Una búsqueda de la tubulina γ revela que este factor de nucleación se localiza a lo largo de los microtúbulos corticales, lo cual sugiere que los nuevos microtúbulos podrían formarse directamente en la superficie de los ya existentes. Esta idea es apoyada por estudios sobre la incorporación de tubulina en células vivas (fig. 9.22a) y por análisis in vitro (fig. 9.22b) que muestran microtúbulos recién formados de manera perpendicular a los lados de otros ya existentes. Una vez formados, es probable que los microtúbulos hijos se desprendan del progenitor y sean incorporados en los haces paralelos que circundan la célula (figs. 9.12a, 9.21).

2. Conforme la célula se aproxima a la mitosis, los microtúbulos desaparecen de la mayor parte de la corteza y dejan sólo una banda transversal llamada banda preprofase, que rodea la célula como un cinturón (paso 2, fig. 9.21). La banda preprofase marca el sitio del futuro plano de división.

3. A medida que la célula progresa hacia la mitosis, la banda preprofase se pierde y los microtúbulos reaparecen en la forma de huso mitótico (fig. 9.21, paso 3).

4. Después de que los cromosomas se separan, el huso mitótico desaparece y se sustituye por un haz de microtúbulos llamado fragmoplasto (fig. 9.21, paso 4), que desempeña una función central en la formación de la pared celular que separa las dos células hijas (véase fig. 14.38).

Se cree que estos cambios drásticos en la organización espacial de los microtúbulos se logran mediante la combinación de dos mecanismos separados: (1) una nueva disposición de los microtúbulos existentes y (2) el desensamble de los microtúbulos existentes con un reensamble de otros nuevos en regiones distintas de la célula. En este último caso, los microtúbulos que constituyen la banda preprofase se forman a partir de las mismas subunidades que unos minutos antes eran parte de la matriz cortical o, antes que eso, del fragmoplasto.

Bases de la dinámica de microtúbulos

Los primeros datos sobre los factores que influyen en los índices de ensamble y desensamble del microtúbulo se obtuvieron de estudios in vitro. La primera estrategia exitosa respecto al ensamble de microtúbulos in vitro fue obra de Richard Weisenberg, de la Temple University, en 1972. Al razonar que los homogeneizados celulares deben tener todas las macromoléculas necesarias para el proceso de ensamble, Weisenberg logró la polimerización de tubulina en homogeneizados completos de cerebro a 37°C con la adición de Mg²⁺, GTP y EGTA (que se une con Ca²⁺, un inhibidor de la polimerización). Weisenberg encontró que los microtúbulos podrían desensamblarse y ensamblarse de nuevo una y otra vez con el solo descenso e incremento de la temperatura en la mezcla de incubación. La figura 9.23 muestra tres microtúbulos que se armaron en el tubo de ensayo a partir de tubulina purificada. Puede verse que uno de los tres microtúbulos contiene sólo 11 protofilamentos (como su diámetro menor lo indica). No resulta inesperado que los microtúbulos ensamblados in vitro tengan cantidades anormales de protofilamentos porque carecen del molde apropiado (fig. 9.20c) que en condiciones normales proporcionan los complejos anulares de tubulina gamma in vivo. El ensamble in vitro de microtúbulos se favorece mucho con la adición de MAP o con fragmentos de microtúbulos o estructuras que los contengan (fig. 9.24), que sirven como moldes para la adición de subunidades libres. En estos estudios in vitro se agregan subunidades de tubulina sobre todo al extremo más del polímero existente.

Desde los primeros estudios in vitro se estableció que el ensamble de microtúbulos requiere GTP. El ensamble de dímeros de tubulina demanda la unión de una molécula de GTP con la subunidad de tubulina beta.³ Como al parecer resulta, finalmente la sup> Como al parecer resulta, finalmente laβ-tubulina no es sólo una proteína estructural, sino también una enzima, una GTPasa. La incorporación real del dímero al final de un microtúbulo no necesita hidrólisis de GTP, sino que el GTP se hidroliza poco después que el dímero se incorpora a un microtúbulo y el GDP resultante permanece unido con el polímero ensamblado. Luego que un dímero se libera de un microtúbulo durante el desensamble e ingresa a la reserva soluble, el GDP se sustituye con un GTP nuevo. Este intercambio de nucleótido “recarga” el dímero y permite que sirva de nuevo como bloque de construcción para la polimerización.

Debido a que la hidrólisis del GTP incluye el ensamble de un microtúbulo, esta no es una actividad celular barata. ¿Por qué se desarrolló una vía de polimerización tan costosa? Para responder esta pregunta es conveniente considerar el efecto de la hidrólisis del GTP en la estructura del microtúbulo. Cuando un microtúbulo crece, el extremo más se ve al microscopio electrónico como una hoja abierta a la que se agregan dímeros-GTP (paso 1, fig. 9.25a, 9.25b). Durante las fases de crecimiento rápido del microtúbulo los dímeros de tubulina se agregan con más rapidez de lo que su GTP puede hidrolizarse. Se cree que la presencia de una capa de dímeros tubulina-GTP en los extremos más de los protofilamentos favorece la adición de más subunidades, con el crecimiento consecuente del microtúbulo. Sin embargo, se supone que los microtúbulos con extremos abiertos, como en el paso 1 de la figura 9.25a, experimentan una reacción espontánea que conduce al cierre del tubo (pasos 2 y 3). En este modelo el cierre del tubo se acompaña de hidrólisis del GTP unido, lo que genera subunidades que contienen tubulina unida con GDP. Las subunidades tubulina-GDP tienen una conformación distinta a sus precursores tubulina-GTP y son menos adecuadas para ajustarse en un protofilamento recto. La tensión mecánica resultante disminuye la estabilidad del microtúbulo. La energía de tensión se libera cuando los protofilamentos se curvan hacia afuera en el extremo más del túbulo y se someten a despolimerización catastrófica (fig. 9.25a, paso 4; fig. 9.25c). Por lo tanto, pareciera que la hidrólisis del GTP es un elemento fundamental de la calidad dinámica de los microtúbulos. La energía de tensión almacenada en un microtúbulo como resultado de la hidrólisis del GTP torna los microtúbulos inestables y capaces de desarmarse poco después de su formación (en ausencia de otros factores estabilizadores como las MAP). Los microtúbulos pueden encogerse con gran rapidez, sobre todo in vivo, lo que permite a la célula desarmar su citoesqueleto microtubular en muy poco tiempo.

La microinyección de tubulina con marca fluorescente en una célula cultivada puede revelar el carácter dinámico del citoesqueleto microtubular dentro de una célula. Las subunidades marcadas se incorporan con rapidez en los microtúbulos preexistentes del citoesqueleto, aun en ausencia de cambios morfológicos (fig. 9.26). Si se observan microtúbulos individuales con el microscopio de fluorescencia, parecen crecer despacio por cierto periodo y luego se encogen con rapidez y en forma inesperada, como lo ilustra la vigilancia del microtúbulo de la figura 9.27. Puesto que el encogimiento ocurre de manera más rápida e inesperada que la elongación, la mayor parte de los microtúbulos desaparece de la célula en cuestión de minutos y se sustituye por microtúbulos nuevos que crecen a partir del centrosoma.

En 1984, Timothy Mitchison y Marc Kirschner, de la University of California, San Francisco, informaron sobre las propiedades de los microtúbulos individuales y propusieron que el comportamiento del microtúbulo podía explicarse por un fenómeno denominado inestabilidad dinámica. La inestabilidad dinámica explica la observación de que (1) el crecimiento y reducción de microtúbulos pueden coexistir en la misma región de una célula y (2) que un microtúbulo determinado puede cambiar de manera impredecible (de manera fortuita) entre las fases de crecimiento y acortamiento, como en la figura 9.27. La inestabilidad dinámica es una propiedad inherente del microtúbulo y, más específicamente, del extremo más del microtúbulo. Como se indica en la figura 9.25, es el extremo más donde se agregan las subunidades durante el crecimiento y del que se pierden durante el acortamiento. Esto no significa que la inestabilidad dinámica no esté influida por factores externos. Por ejemplo, las células contienen un conjunto diverso de proteínas (llamadas +TIP) que se unen con los extremos más dinámicos de los microtúbulos. Algunas de estas +TIP regulan la velocidad de crecimiento o acortamiento del microtúbulo o la frecuencia de intercambio entre estas dos fases. Otras +TIP median la unión del extremo más del microtúbulo con una estructura celular específica, como el cinetocoro de un cromosoma mitótico durante la división celular, o el citoesqueleto de actina de la corteza durante el transporte en vesículas. Una vez que se une una estructura subcelular al extremo más de un microtúbulo, las propiedades dinámicas del microtúbulo pueden ejercer fuerza sobre la estructura. La polimerización de un microtúbulo puede desplazar un objeto unido, en sentido centrífugo, en tanto que la despolimerización de la misma estructura puede hacer que el objeto en cuestión se dirija en sentido centrípeto. Por ejemplo, este tipo de fuerzas de “arrastre” interviene decisivamente en la segregación de los cromosomas durante la división celular (sección 14.2).

La inestabilidad dinámica constituye un mecanismo por medio del cual los extremos más de los microtúbulos pueden explorar rápidamente el citoplasma en busca de sitios de fijación apropiados. La fijación estabiliza temporalmente los microtúbulos y permite a la célula construir las complejas redes citoesqueléticas que se exponen en este capítulo. La inestabilidad dinámica también permite a las células reaccionar rápidamente a las condiciones cambiantes que requieren remodelación del citoesqueleto microtubular. Uno de los ejemplos más notables de tal remodelación se presenta en la mitosis, cuando los microtúbulos del citoesqueleto se desensamblan y remodelan en un huso mitótico bipolar. Esta reorganización se asocia con un intenso cambio en la estabilidad microtubular; los microtúbulos de las células en interfase tienen vidas medias cinco a 10 veces mayores que los de las células mitóticas. A diferencia de los microtúbulos del huso mitótico o el citoesqueleto, los de los organelos que se consideran a continuación carecen de actividad dinámica y son muy estables.

Cilios y flagelos: estructura y función

Cualquiera que haya colocado una gota de agua de un estanque bajo la lente del microscopio e intentado impedir que un protozoario nadara fuera del campo de visión puede apreciar la actividad de los cilios y los flagelos. Los cilios y los flagelos son organelos móviles similares a pelos que sobresalen de la superficie de diversas células eucariotas. Las bacterias también tienen estructuras conocidas como flagelos, pero los flagelos de los procariotas son filamentos simples sin relación evolutiva con sus contrapartes eucariotas (véase fig. 1.14). La explicación siguiente se refiere sólo a los organelos de células eucariotas.

En esencia los cilios y los flagelos son la misma estructura. La mayoría de los biólogos usa uno u otro término con base en el tipo de célula del que el organelo se proyecta y su patrón de movimiento. De acuerdo con esta distinción, un cilio puede compararse con un remo que mueve la célula en sentido perpendicular al cilio mismo. Durante su desplazamiento el cilio se mantiene rígido (fig. 9.29a) mientras empuja contra el medio circundante. En su movimiento de recuperación el cilio se vuelve flexible y ofrece poca resistencia al medio. Los cilios tienden a encontrarse en grandes cantidades sobre la superficie celular y su actividad suele ser coordinada (fig. 9.29b). Los cilios mueven líquido y partículas a través de diversas vías en los organismos pluricelulares (fig. 9.29c). Por ejemplo, en los seres humanos el epitelio ciliado que recubre las vías respiratorias impulsa el moco y los detritos atrapados en él para alejarlos de los pulmones. No todos los cilios son móviles; muchas células del cuerpo tienen un solo cilio inmóvil (cilio primario) y se cree que desempeña una función sensorial al vigilar las propiedades de los líquidos extracelulares. Algunas de las funciones de los cilios únicos móviles e inmóviles se explican en la sección “Perspectiva humana”.

Los flagelos se presentan en forma individual o en pares y tienen diversos patrones de movimiento (ondas), según el tipo celular. Por ejemplo, el alga unicelular que se presenta en la figura 9.30a se impulsa hacia el frente con las sacudidas de sus dos flagelos en forma asimétrica, semejante a la brazada de pecho de un nadador humano (fig. 9.30b). Esta misma alga puede empujarse a sí misma por el medio con un movimiento simétrico similar al del espermatozoide (mostrado en la figura 9.35). La concentración interna del ion de calcio regula el grado de asimetría del patrón de movimiento del alga.

La micrografía electrónica de un corte transversal de un cilio o un flagelo es una de las imágenes más familiares de la biología celular (fig. 9.31a). Toda la proyección ciliar o flagelar está cubierta por una membrana que se continúa con la membrana plasmática de la célula. El centro del cilio, llamado axonema, contiene un conjunto de microtúbulos que corre en sentido longitudinal por todo el organelo. Con raras excepciones, el axonema de un cilio o flagelo móvil tiene nueve microtúbulos dobles periféricos que rodean un par central de microtúbulos. Esta misma estructura microtubular, que se conoce como “disposición 9 + 2”, se observa en los axonemas desde los protistas hasta los mamíferos y sirve como otro de los muchos recordatorios de que todas las células eucariotas vivas evolucionaron de un ancestro común. Todos los microtúbulos del axonema tienen la misma polaridad; sus extremos más se hallan en la punta de la proyección y los extremos menos, en la base. Cada pareja periférica consiste en un microtúbulo completo, el túbulo A, y un microtúbulo incompleto, el túbulo B; este último alberga 10 u 11 subunidades en lugar de las 13 usuales.

La estructura básica del axonema se describió por primera vez en 1952; Irene Manton lo hizo en las plantas y Don Fawcett y Keith Porter, en células animales. (Los flagelos se perdieron durante la evolución de las plantas superiores.) Algunos de los componentes menos evidentes se hicieron visibles conforme el poder de resolución de los microscopios electrónicos mejoró (fig. 9.31b). Se observó que los túbulos centrales están rodeados por la vaina central, que está conectada con los túbulos A de los dobletes periféricos mediante un conjunto de estructuras radiales. Las parejas están conectadas entre sí por un puente entre parejas formado por una proteína elástica, la nexina. La observación de un par de “brazos” (un brazo interno y un brazo externo), que se proyectan del túbulo A (fig. 9.31a) fue muy importante. Un corte longitudinal, o sea, uno que pasa por el axonema paralelo a su eje longitudinal, revela la naturaleza continua de los microtúbulos y la naturaleza discontinua de los otros elementos (fig. 9.32a).

Como se indicó antes, un cilio o flagelo surge de un cuerpo basal (fig. 9.33a) de estructura similar al centríolo de la figura 9.18a. Los túbulos A y B del cuerpo basal se elongan para formar las parejas del cilio o del flagelo (fig. 9.33b). Si un cilio o flagelo se arranca de la superficie de una célula viva, un nuevo organelo se regenera como excrecencia del cuerpo basal. Como sucede con otras estructuras microtubulares, el crecimiento de un axonema ocurre en los extremos más (externos) de sus microtúbulos. ¿Cómo es que una célula organiza y mantiene un sitio de construcción en la punta externa del axonema situado a micras del cuerpo de la célula donde la síntesis de los materiales de construcción tiene lugar?

Transporte intraflagelar

Aunque los biólogos han observado los flagelos de células vivas durante más de cien años, fue hasta 1993 que Joel Rosembaum y colaboradores, de Yale University, vieron el movimiento de las partículas en el espacio entre las parejas periféricas y la membrana plasmática circundante del flagelo. Estudios posteriores revelaron un proceso conocido como transporte intraflagelar (IFT, intraflagellar transport), que se encarga de ensamblar y mantener estos organelos. El IFT depende del movimiento dirigido hacia ambos extremos, más y menos, a lo largo de los microtúbulos (fig. 9.34). La cinesina-2 mueve matricies complejas de partículas junto con materiales de construcción, a lo largo de protofilamentos de las parejas periféricas hasta el sitio de ensamble en la punta del axonema en crecimiento. Las moléculas de cinesina-2 (y las proteínas axonémicas recicladas) se transportan de nuevo al cuerpo basal por los mismos microtúbulos flagelares mediante un mecanismo impulsado por dineína citoplásmica. Estudios recientes también implicaron a IFT en el transporte de varias moléculas de señalización importantes. Varios de los rasgos característicos del síndrome de Bardet-Biedl, incluidos la obesidad y los dedos supernumerarios, pueden rastrearse hasta trastornos en el transporte de moléculas de señalización.

Los brazos de dineína

La maquinaria para la locomoción ciliar y flagelar se encuentra dentro del axonema. Esto se ilustra en el experimento mostrado en la figura 9.35, en la que el axonema de la cola de un espermatozoide, carente de la membrana que lo cubre, aún es capaz de efectuar movimientos sostenidos y normales en presencia de Mg²⁺ y ATP agregados. A mayor concentración de ATP, mayor frecuencia de los movimientos de estos organelos “reactivados”.

Ian Gibbons, de la Harvard University, aisló la proteína que se encarga de la conversión de la energía química del ATP en energía mecánica de locomoción ciliar en el decenio de 1960. Los experimentos de Gibbons brindan un ejemplo elegante de la relación entre la estructura y la función en los sistemas biológicos y los medios por los que la relación puede revelarse mediante el análisis experimental. Gibbons utilizó varias soluciones capaces de disolver distintos componentes y realizó la disección química de los cilios del protozoario Tetrahymena (fig. 9.36). En el paso 1 se muestra el corte transversal de un cilio intacto. La disección comenzó con la solubilización de la membrana plasmática en el detergente digitonina (paso 2). Los axonemas aislados de la fracción insoluble se sumergieron en una solución con EDTA, un compuesto que une iones divalentes y los retira (por quelación). Cuando los axonemas tratados con EDTA se examinaron bajo el microscopio electrónico, los túbulos centrales no estaban, lo mismo que los brazos que sobresalen de los túbulos A (paso 3). De manera simultánea con la pérdida de estas estructuras, los axonemas insolubles perdieron su capacidad para hidrolizar ATP, propiedad que el sobrenadante ganó. La ATPasa encontrada en el sobrenadante era una proteína enorme (de hasta 2 millones de Da) que Gibbons denominó dineína (de las palabras dyne, que significa “fuerza” y proteína). Esta proteína ahora se conoce como dineína ciliar (o axonémica) para distinguirla de la dineína citoplásmica, una proteína relacionada que participa en el transporte de organelos y partículas. Cuando las partes insolubles del axonema se mezclaron con la proteína soluble en presencia de Mg²⁺, gran parte de la actividad de la ATPasa se vinculó de nuevo con el material insoluble en la mezcla (paso 4). El examen de la fracción insoluble mostró que los brazos habían reaparecido en los túbulos A de los axonemas. Gibbons concluyó que los brazos vistos en las micrografías eran equivalentes a las moléculas de ATPasa de dineína recuperadas en la solución con EDTA, por lo que eran los brazos los que liberaban la energía necesaria para la locomoción.

En investigaciones posteriores se observó que el tratamiento de axonemas aislados de espermatozoides con solución hipertónica (0.6 M de NaCl) eliminaba en forma selectiva los brazos externos y dejaba los internos en su sitio (paso 5). Cuando se agregaba ATP a los axonemas que carecían de los brazos externos, éstos se movían a la mitad de la velocidad del axonema intacto, aunque realizaron el movimiento en forma de onda normal.

La figura 9.37a muestra una micrografía electrónica de la molécula de dineína externa (dineína del brazo externo) del axonema de Tetrahymena. Esta molécula de dineína consiste en tres cadenas pesadas y varias cadenas intermedias y ligeras. Como se describe en la página 337, cada cadena pesada de dineína está formada por un pie largo, una cabeza con forma de rueda y un tallo. La figura 9.37b,c presenta micrografías electrónicas de alta resolución de cadenas pesadas individuales de dineína de flagelos de Chlamydomonas preparados en dos condiciones distintas. Se propone que la diferencia en la conformación entre las moléculas de estas dos micrografías (mostradas unidas en la fig. 9.37d) representa la aplicación de energía cinética de la dineína, una proteína motora flagelar. En este modelo, la rotación de la cabeza mostrada en la figura 9.37b′,c′ sirve como fuerza impulsora básica para los movimientos ciliar y flagelar. Para comprender el mecanismo que permite este tipo de movilidad hay que reconsiderar la estructura del axonema.

El mecanismo de locomoción ciliar y flagelar

Como se explica más adelante en este capítulo, la contracción del músculo se debe al deslizamiento de los filamentos de actina sobre los filamentos adyacentes de miosina. La fuerza de deslizamiento se genera en los enlaces cruzados semejantes a trinquetes que se encuentran en la cabeza de la molécula de miosina. Con el sistema muscular como modelo, se propuso que el movimiento ciliar podía explicarse por el deslizamiento de parejas de microtúbulos adyacentes entre sí. De acuerdo con esta idea, los brazos de dineína mostrados en la figura 9.37 actúan como puentes colgantes que generan las fuerzas necesarias para el movimiento ciliar o flagelar. La figura 9.38 presenta la secuencia de estos acontecimientos.

En el axonema intacto, el tallo de cada molécula de dineína (con sus cadenas intermedias y ligeras asociadas) está anclado con firmeza a la superficie del túbulo A, con las cabezas globulares y los tallos proyectados hacia el túbulo B de la pareja vecina. En el paso 1 de la figura 9.38, los brazos de dineína anclados en el túbulo A de la pareja inferior se adhieren a los sitios de unión del túbulo B de la pareja superior. En el paso 2, las moléculas de dineína experimentan un cambio en la conformación, o aplicación de energía, que ocasiona el deslizamiento de la pareja inferior hacia el extremo basal de la pareja superior. Este cambio en la conformación de la cadena pesada de dineína se muestra en la figura 9.37b-d. En el paso 3 de la figura 9.38, los brazos de dineína se desprendieron del túbulo B del doblete superior. En el paso 4, los brazos se unieron de nuevo a la pareja superior para iniciar un nuevo ciclo. (La figura 18.18 presenta una micrografía electrónica del corte transversal a través del cilio con los brazos de dineína de una pareja unidos a la pareja adyacente.)

La nexina es una proteína elástica que conecta los dobletes adyacentes (fig. 9.31). Estos puentes de nexina tienen una función importante en el movimiento ciliar y flagelar porque limitan la distancia de deslizamiento de los dobletes adyacentes uno sobre otro. La resistencia al deslizamiento que ejercen los puentes de nexina hace que el axonema se doble como respuesta a la fuerza de deslizamiento. El deslizamiento de un lado del axonema se alterna con el deslizamiento del otro lado, de manera que una parte del cilio o flagelo se flexiona primero en una dirección y luego en la dirección contraria (fig. 9.39). Para esto es necesario que, en un momento determinado, los brazos de dineína de un lado del axonema estén activos, en tanto que los del otro lado están inactivos. Como resultado de esta diferencia en la actividad de la dineína, las parejas del lado interno del doblez (correspondientes a las partes superior e inferior de la figura 9.39) se extienden más allá que las del lado contrario del axonema.

Se acumula evidencia constante en favor de la teoría del microtúbulo deslizante y de la función de los brazos de dineína. El deslizamiento del microtúbulo en los axonemas flagelares en movimiento se observó ya en forma directa, como lo ilustran las fotografías de la figura 9.40. En este experimento los axonemas aislados se incubaron con cuentas diminutas de oro que se unieron a la superficie externa expuesta de las parejas periféricas. Las cuentas sirvieron como marcadores fijos de sitios específicos en las parejas. Luego se vigiló la posición relativa de las cuentas mientras los axonemas se estimularon para moverse con la adición de ATP. Conforme los axonemas se doblaron a uno y otro lado, la distancia entre las cuentas de las distintas parejas aumentó y disminuyó en forma alternada (fig. 9.40), como era de esperarse si las parejas vecinas se deslizaran de ida y vuelta una sobre la otra.

El segundo de los tres principales elementos del citoesqueleto que se describe se observó al microscopio electrónico como filamentos sólidos, no ramificados con un diámetro de 10 a 12 nm. Se denominaron filamentos intermedios (IF, intermediate filaments). Hasta ahora, los filamentos intermedios sólo se han encontrado en células animales. Son fibras fuertes, flexibles, parecidas a cuerdas que aportan fuerza mecánica a las células sometidas a tensión física, como las neuronas, células musculares y las células epiteliales que recubren las cavidades del cuerpo. A diferencia de los microfilamentos y microtúbulos, los IF son un grupo de estructuras con composición química heterogénea que en los humanos están codificados por cerca de 70 genes distintos. Las subunidades polipeptídicas de los IF pueden dividirse en cinco clases principales según el tipo de célula en la que se encuentran (cuadro 9.2) y con base en criterios bioquímicos, genéticos e inmunológicos. Esta descripción se limita a las clases I-IV, que forman parte de la composición de filamentos citoplásmicos y se consideran los IF tipo V (las láminas), que se describen como parte del recubrimiento interno del núcleo, en la sección 12.2.

Los IF tienen una disposición radial por todo el citoplasma de una gran variedad de células animales y a menudo están interconectados con otros filamentos del citoesqueleto mediante enlaces cruzados delgados y ralos (fig. 9.41). En muchas células, estos puentes cruzados consisten en una proteína dimérica alargada llamada plectina, de la cual hay muchas isoformas. Cada molécula de plectina tiene un sitio de unión para un filamento intermedio en un extremo y, según la isoforma, un sitio de unión para otro filamento intermedio, un microfilamento o un microtúbulo en el otro extremo.

Aunque los polipéptidos de los IF tienen diversas secuencias de aminoácidos, todos comparten una organización estructural semejante, lo que les permite formar filamentos de apariencia similar. Lo más notable es que los polipéptidos de todos los IF contienen un dominio helicoidal α central cilíndrico de longitud semejante y secuencia homóloga de aminoácidos. Este largo dominio fibroso hace que las subunidades de los filamentos intermedios sean muy distintas de las subunidades globulares de la tubulina y la actina de los microtúbulos y microfilamentos. El dominio fibroso central está flanqueado a ambos lados por dominios globulares de tamaño y secuencia variables (paso 1, fig. 9.42). Dos de estos polipéptidos interactúan en forma espontánea cuando sus cilindros helicoidales alfa se envuelven uno alrededor del otro en un rizo para formar un dímero parecido a una cuerda de unos 45 nm de largo (paso 2). Como los dos polipéptidos se alinean paralelos entre sí en la misma orientación, el dímero tiene polaridad, con un extremo definido por el extremo carboxilo de los polipéptidos y el extremo contrario por sus extremos amino terminal.

Ensamble y desensamble de filamentos intermedios

Se cree que el bloque de construcción básico del ensamble de IF es un tetrámero cilíndrico formado por dos dímeros que se alinean lado a lado en forma escalonada, con sus extremos amino y carboxilo en sentidos opuestos (antiparalelos), como se muestra en la figura 9.42, paso 3 y en la figura 9.42b. Como los dímeros apuntan en direcciones contrarias, el tetrámero completo carece de polaridad. Estudios recientes del autoensamble de los IF in vitro sugiere que ocho tetrámeros se unen entre sí en disposición lateral (lado a lado) para formar un filamento que tiene una unidad de largo (alrededor de 60 nm) (paso 4). El crecimiento ulterior del polímero se logra cuando estas longitudes unitarias de filamentos se asocian entre sí en forma término-terminal para formar un filamento intermedio muy largo (paso 5). Se cree que ninguno de estos pasos del ensamble requiere la participación directa de ATP o GTP. Puesto que los bloques tetraméricos de construcción carecen de polaridad, el filamento ensamblado tampoco la tiene, otra característica que distingue los IF de otros elementos del citoesqueleto.

Los filamentos intermedios tienden a ser menos sensibles a los agentes químicos que otros tipos de elementos del citoesqueleto y más difíciles de disolver. De hecho, el tratamiento de una célula con detergentes iónicos extrae prácticamente todo el material, salvo los filamentos intermedios de ella. A causa de su insolubilidad, al principio se pensó que los IF eran estructuras permanentes e inmutables, por lo que sorprendió encontrar que tienen un comportamiento dinámico in vivo. Cuando subunidades marcadas de queratina se inyectaron en cultivos de células cutáneas, se incorporaron con rapidez en los IF existentes. Algo que resultó sorprendente es que las subunidades no se incorporan en los extremos del filamento, como podría esperarse por analogía con el ensamble de microtúbulos y microfilamentos, sino que se incluyen en el interior del filamento (fig. 9.43). Los resultados mostrados en la figura 9.43 podrían reflejar el intercambio de longitudes unitarias del filamento (como se muestra en el paso 6, figura 9.42a) directamente a una red ya existente de IF. A diferencia de los otros dos elementos principales del citoesqueleto, el ensamble y desensamble de los IF se controlan sobre todo por fosforilación y desfosforilación de las subunidades. Por ejemplo, la fosforilación de los filamentos de vimentina por acción de la proteína cinasa A conduce al desensamble.

Tipos y funciones de los filamentos intermedios

Los filamentos de queratina constituyen las principales proteínas estructurales de las células epiteliales (entre ellas células epidérmicas, hepatocitos y células acinares pancreáticas). La figura 9.44a muestra un esquema de la disposición espacial de los filamentos de queratina de una célula epitelial generalizada y la figura 9.44b presenta la disposición real dentro de un par de células epidérmicas cultivadas. Los IF que contienen queratina tienen disposición radial a través del citoplasma, fijan la envoltura nuclear en el centro de la célula y en el borde externo de la célula mediante conexiones con las placas citoplásmicas de desmosomas y hemidesmosomas (págs. 257 y 249). La figura 9.44a también muestra las interconexiones entre los IF y los microtúbulos y microfilamentos de la célula, lo que transforma a estos elementos por lo demás separados en un citoesqueleto integrado. Por estas conexiones físicas variadas, la red de IF es capaz de funcionar como un andamiaje para la organización y mantenimiento de la estructura celular y para absorber la tensión mecánica aplicada por el ambiente extracelular.

El citoplasma de las neuronas contiene haces laxos de filamentos intermedios cuyo eje longitudinal se orienta en paralelo con el del axón de la célula nerviosa (véase fig. 9.13b). Estos IF, o neurofilamentos, como se les conoce, están formados por tres proteínas distintas: NF-L, NF-H y NF-M, todas del tipo del grupo IV del cuadro 9.2. A diferencia de los polipéptidos de otros filamentos intermedios, NF-H y NF-M tienen brazos laterales que se proyectan fuera del neurofilamento. Se piensa que estos brazos laterales mantienen el espacio apropiado entre los neurofilamentos paralelos del axón (véase fig. 9.13b). En las etapas iniciales de diferenciación, cuando el axón crece hacia una célula blanco, contiene muy pocos neurofilamentos pero grandes cantidades de microtúbulos de soporte. Una vez que la célula nerviosa se extendió por completo, se llena con neurofilamentos que le brindan soporte mientras el diámetro del axón crece en forma notable. La agregación de NF se observa en varios trastornos neurodegenerativos del ser humano, como ALS y enfermedad de Parkinson. Estos agregados de NF pueden bloquear el transporte axónico, lo que ocasiona la muerte de las neuronas afectadas.

Los esfuerzos para valorar la función de los IF dependen en gran medida de estudios en ratones con modificaciones genéticas, que no les permiten producir un polipéptido particular de los IF (deleción génica) o que sintetizan un polipéptido de IF alterado. Tales estudios revelaron la importancia de los filamentos intermedios en tipos particulares de células. Por ejemplo, los ratones con deleciones en el gen que codifica para K14, un tipo de polipéptido de queratina tipo I que suele sintetizarse en células de la capa basal de la epidermis, tienen problemas graves de salud. Estos ratones son tan sensibles a la presión mecánica que aun un traumatismo leve, como el que ocurre durante el paso por el canal del parto o durante el amamantamiento del recién nacido, puede causar la formación de vesículas graves en la piel o la lengua. Este fenotipo se parece mucho a una rara enfermedad ampollar de la piel en los seres humanos, la epidermólisis ampollosa simple (EBS, epidermolysis bullosa simplex).⁴ El análisis posterior de pacientes con esta enfermedad mostró que tienen mutaciones en el gen que codifica el polipéptido homólogo K14 (o el polipéptido K5, que forma dímeros con K14). Estos estudios confirman la participación de los IF en la impartición de fuerza mecánica a las células de las capas epiteliales. Del mismo modo, los ratones con deleciones génicas que no producen el polipéptido desmina muestran alteraciones graves en los músculos estriado y cardiaco. La desmina desempeña una función estructural clave para mantener la alineación de las miofibrillas de una célula muscular y la ausencia de estos IF torna muy frágiles las células. Una enfermedad humana hereditaria, la miopatía relacionada con desmina, se debe a mutaciones en el gen que codifica esta proteína. Las personas con este trastorno sufren debilidad muscular esquelética, arritmias cardiacas y por último insuficiencia cardiaca congestiva. No todos los polipéptidos de los IF cumplen funciones tan esenciales. Por ejemplo, los ratones que carecen del gen para vimentina, que se expresa en los fibroblastos, macrófagos y leucocitos, muestran anomalías relativamente menores, aunque las células afectadas carecen de IF citoplásmicos. En estos estudios queda en evidencia que los IF tienen funciones específicas por tejidos, más importantes en unas células que en otras.

Las células poseen una notable capacidad para moverse. Las células de la cresta neural de un embrión vertebrado salen del sistema nervioso en desarrollo y migran por todo lo ancho del embrión para formar productos tan diversos como las células pigmentarias de la piel, los dientes y el cartílago de las mandíbulas (véase fig. 7.11). Legiones de leucocitos patrullan los tejidos del cuerpo en busca de detritos y microorganismos. Ciertas partes de las células también pueden moverse; las amplias proyecciones de las células epiteliales en el borde de una herida actúan como dispositivos móviles que tiran de la hoja de células para cubrir el área dañada y sellar la herida. De igual manera el borde activo de un axón en crecimiento emite procesos microscópicos que exploran el sustrato y guían la célula hacia la célula con la que harán sinapsis. Todos estos ejemplos de motilidad comparten al menos un componente: todos dependen de microfilamentos, el tercer tipo principal de elemento del citoesqueleto. Los microfilamentos también participan en los procesos de la motilidad intracelular, como el movimiento de vesículas, fagocitosis y citocinesis. De hecho, las células vegetales dependen sobre todo de los microfilamentos, en lugar de los microtúbulos, para el transporte a grandes distancias de las vesículas citoplásmicas y organelos. Esta tendencia hacia la movilidad basada en microfilamentos refleja la distribución bastante limitada de los microtúbulos en muchas células vegetales (véase fig. 9.12). Los microfilamentos también intervienen de manera importante como elemento que gobierna la forma de las células y brinda apoyo estructural en diversos tipos de prolongaciones o proyecciones celulares (como se observa en la fig. 9.66).

Los microfilamentos miden alrededor de 8 nm de diámetro y se componen de subunidades globulares de la proteína actina, la proteína más abundante en la mayoría de las células. En presencia de ATP, los monómeros de actina se polimerizan para formar un filamento helicoidal flexible. Como resultado de esta organización en subunidades (fig. 9.45a), un filamento de actina es en esencia una estructura de dos cadenas con dos hendiduras helicoidales que recorren toda su longitud (fig. 9.54b). Los términos filamento de actina, actina-F y microfilamento son sinónimos para este tipo de filamento. Como cada subunidad de actina tiene polaridad y todas las subunidades de un filamento de actina se orientan en la misma dirección, todo el microfilamento tiene polaridad. Por consiguiente, los dos extremos de un filamento de actina tienen distintas estructuras y propiedades dinámicas. Según el tipo de célula y la actividad en la que participa, los filamentos de actina pueden organizarse en conjuntos muy ordenados, en redes laxas y poco definidas o en haces anclados con firmeza.

Es posible identificar con seguridad los filamentos de actina en una célula determinada con una prueba citoquímica que aproveche el hecho de que los filamentos de actina interactúan en forma muy específica con la proteína miosina, sin importar el sitio de origen de la actina. Para facilitar la interacción, la miosina purificada (obtenida de tejido muscular) se divide en fragmentos mediante la acción de una enzima proteolítica. Uno de estos fragmentos, llamado S1 (véase fig. 9.49), se une con las moléculas de actina a todo lo largo del microfilamento. Además de identificar los filamentos como actina, los fragmentos unidos de S1 revelan la polaridad del filamento. Cuando los fragmentos S1 se unen, un extremo del microfilamento se ve afilado como la punta de una flecha, mientras que el otro se observa barbado. La figura 9.46 presenta un ejemplo de esta “decoración” en punta de flecha en las microvellosidades de las células epiteliales intestinales. La orientación de las puntas de flecha formadas por el complejo S1-actina brinda información respecto a la dirección en la que es probable que los microfilamentos se muevan por medio de una proteína motora miosina. La actina también puede localizarse con el microscopio óptico si se utiliza faloidina con marca fluorescente (fig. 9.74a), que se une con los filamentos de actina o con anticuerpos contra actina marcados con fluorescencia.

La actina se clasificó hace más de 50 años como una de las principales proteínas contráctiles de las células musculares. Desde entonces, se ha identificado como una proteína principal en todos los tipos de células eucariotas que se hayan examinado. Las especies vegetales superiores y animales tienen varios genes codificadores de actina cuyos productos codificados se especializan en distintos tipos de procesos motrices. Las actinas se han conservado en forma notable a lo largo de la evolución de las células eucariotas. Por ejemplo, las secuencias de aminoácidos de moléculas de actina de una levadura y de una célula de músculo estriado de conejo son idénticas en 88%. De hecho, las moléculas de actina de distintas fuentes pueden polimerizarse juntas para formar filamentos híbridos. Los filamentos de actina por sí mismos generan fuerzas (pág. 374), pero muchos de los fenómenos en que interviene la actina necesitan de la actividad de proteínas motoras, de manera específica las de la superfamilia de la miosina.

Ensamble y desensamble de microfilamentos

Antes de incorporarse en un microfilamento, un monómero de actina se enlaza con una molécula de ATP. La actina es una ATPasa, tal como la tubulina es una GTPasa, y la función del ATP en el ensamble de la actina es similar a la del GTP en el armado de un microtúbulo (pág. 342). El ATP unido con un monómero de actina se hidroliza en ADP en algún momento después de su incorporación en el filamento de actina en crecimiento. Por lo tanto, la mayor parte del filamento de actina consiste en subunidades ADP-actina.

La polimerización de la actina es fácil de demostrar in vitro en soluciones que contienen monómeros de ATP-actina. Como en el caso de los microtúbulos, la etapa inicial en la formación de filamentos (o sea, la nucleación) es lenta, en tanto que la etapa posterior de elongación del mismo es mucho más rápida. La etapa de nucleación de la formación de un filamento puede evitarse si se incluyen filamentos de actina ya formados en la mezcla de reacción. Cuando los filamentos de actina ya formados se incuban con una concentración alta de monómeros de actina marcados con ATP, ambos extremos del microfilamento se marcan, pero uno tiene mayor afinidad por los monómeros y los incorpora a una velocidad casi 10 veces mayor que el otro extremo. La decoración con el fragmento S1 de miosina revela que el extremo barbado (o más) del microfilamento es el que crece con mayor rapidez, mientras que el extremo afilado (o menos) es la punta de crecimiento lento (fig. 9.47a).

La figura 9.47b ilustra cómo los fenómenos que ocurren durante el ensamble y el desensamble de actina in vitro dependen de la concentración de monómeros de actina. Supóngase que se comienza con la adición de filamentos preformados de actina (semillas) a una solución de actina en presencia de ATP (paso 1). En tanto la concentración de monómeros ATP-actina permanezca alta, continuará la adición de subunidades en ambos extremos del filamento (fig. 9.47b, paso 2). Conforme los monómeros en la mezcla de reacción se consumen mediante adición a los extremos de los filamentos, la concentración de monómeros ATP-actina libres continúa en descenso hasta llegar a un punto en que la adición de monómeros continúa en el extremo más, que tiene mayor afinidad por ATP-actina, pero cesa en el extremo menos, cuya afinidad por ATP-actina es menor (paso 3). La concentración de monómeros libres se reduce aún más conforme el alargamiento del filamento continúa. En este momento aún se agregan monómeros en el extremo más de los filamentos, pero hay una pérdida neta de subunidades en el extremo menos. Cuando la concentración de monómeros disminuye más, se alcanza un punto en el que las dos reacciones en los extremos opuestos de los filamentos se equilibran, de manera que la concentración de monómeros libres permanece constante (paso 4). Este tipo de equilibrio entre dos actividades contrarias es un ejemplo de estado estable (pág. 94) y ocurre cuando la concentración de ATP-actina es cercana a 0.3 μM. Como las subunidades se agregan en los extremos más y se eliminan de los extremos menos de cada filamento en estado estable, la posición relativa de las subunidades individuales en cada filamento está en constante movimiento, un proceso que se conoce como cinta sin fin (pasos 4 a 5). Los estudios en células vivas que contienen subunidades de actina con marca fluorescente apoyan que el efecto de cinta sin fin ocurre in vivo (véase fig. 9.54c).

Como se explica en la página 372, la velocidad de ensamble y desensamble de los filamentos de actina en la célula depende de varias proteínas “accesorias” diferentes. Los cambios en las condiciones locales en una región particular de la célula pueden desviar el equilibrio hacia el ensamble o el desensamble de los microfilamentos. Con el control de este equilibrio, la célula puede reorganizar su citoesqueleto de microfilamentos. Tal reorganización es necesaria para los procesos dinámicos como la locomoción celular, los cambios en la forma celular y la citocinesis.

Como se mencionó antes, los filamentos de actina participan en casi todos los procesos motrices de la célula. La participación de estos filamentos es fácil de demostrar si las células se tratan con alguno de los fármacos siguientes que interrumpen las actividades basadas en la dinámica de los microfilamentos: citocalasina, obtenida de un moho y que se une con los extremos más de los filamentos de actina, lo que permite la despolimerización en el extremo menos; faloidina, obtenida de un hongo venenoso y que se une con los filamentos intactos de actina para impedir su recambio y latrunculina, obtenida de una esponja y que se une con los monómeros libres para bloquear su incorporación en el polímero. Los procesos mediados por microfilamentos se detienen pronto cuando alguno de estos compuestos ingresa a la célula.

Miosina: el motor molecular de los filamentos de actina

Ya se examinaron la estructura y las acciones de los motores moleculares, cinesina y dineína, que operan en sentidos opuestos sobre rieles de microtúbulos. Hasta ahora todos los motores conocidos que funcionan con los filamentos de actina son miembros de la superfamilia de la miosina. Las miosinas (con la notable excepción de la miosina IV, que se analiza más adelante) se mueven hacia el extremo más de un filamento de actina.

La miosina se aisló por primera vez del músculo estriado de los mamíferos y luego de diversas células eucariotas, inclusive protistas, plantas, células extramusculares de animales y tejidos musculares cardiaco y liso de los vertebrados. Todas las miosinas comparten un dominio motor característico (cabeza). La cabeza contiene un sitio que se une con un filamento de actina y uno que se une con el ATP y lo hidroliza para impulsar el motor de miosina. Aunque los dominios de cabeza de varias miosinas son similares, los dominios de la cola son muy diversos. Las miosinas también contienen varias cadenas de bajo peso molecular (ligeras). Las miosinas suelen dividirse en dos grandes grupos, las miosinas convencionales (o tipo II) que se identificaron por primera vez en el tejido muscular y las miosinas no convencionales. Las miosinas no convencionales se dividen con base en la secuencia de aminoácidos por lo menos en 17 tipos distintos (tipos I y III a XVIII). Algunas de estas clases se expresan de manera nativa en las células eucariotas, mientras que otras son limitadas. Por ejemplo, la miosina X sólo se encuentra en vertebrados y las miosinas VIII y XI sólo están presentes en plantas. Los humanos tienen cerca de 40 miosinas distintas de por lo menos 12 clases y se supone que cada una tiene una o más funciones especializadas. Las más conocidas de las diversas miosinas son las de tipo II.

Miosinas convencionales (tipo II)

Las proteínas de clase miosina II son los principales motores para la contracción muscular y se encuentran en diversas células extramusculares. El genoma humano codifica 16 cadenas pesadas distintas de miosina II, tres de las cuales funcionan en células no musculares. Todas las moléculas de miosina tipo II se desplazan hacia el extremo “más” (con barbas) de un filamento de actina. Entre sus actividades no musculares, las miosinas tipo II son necesarias para separar a la célula en dos durante la división celular, generan tensión en las adhesiones focales, migración celular y en la capacidad para cambiar de dirección de los conos de crecimiento (fig. 9.76). La figura 9.48 ilustra el efecto de la inhibición de la actividad de la miosina II en un cono de crecimiento en avance.

La figura 9.49a muestra una micrografía electrónica de un par de moléculas de miosina II. Cada molécula está formada por seis cadenas polipeptídicas (un par de cadenas pesadas y dos pares de cadenas ligeras), que se organizan de tal forma que producen una proteína muy asimétrica (fig. 9.49a). El examen de la molécula de la figura 9.49b muestra que consiste en: (1) un par de cabezas globulares que contienen el sitio catalítico de la molécula, (2) un par de cuellos, cada uno formado por una sola hélice alfa continua y dos cadenas ligeras unidas y (3) una sola cola cilíndrica formada por secciones helicoidales α largas de las dos cadenas pesadas.

Las cabezas de miosina aisladas (fragmentos S1 de la figura 9.49b) que se inmovilizaron en la superficie de un cubreobjetos de vidrio son capaces de deslizar los filamentos de actina unidos, en una prueba in vitro como la que se muestra en la figura 9.50. Por lo tanto, toda la maquinaria necesaria para la actividad motriz está contenida en una sola cabeza. El mecanismo de acción de la cabeza de miosina y la participación clave del cuello se explican en la página 369. La porción fibrosa de la cola de una molécula de miosina II tiene una función estructural, que permite que la proteína forme filamentos. Las moléculas de miosina II se ensamblan de tal modo que los extremos de las colas apuntan al centro del filamento y las cabezas globulares señalan al lado contrario del centro (figs. 9.51 y 9.57). Como resultado, el filamento se describe como bipolar, lo que indica una inversión de la polaridad en el centro del filamento. Puesto que son bipolares, las cabezas de miosina en los extremos opuestos de un filamento de miosina tienen la capacidad de tirar de los filamentos de actina para aproximarlos, como ocurre en una célula muscular. Como se describe en la siguiente sección, los filamentos de miosina II que se ensamblan en las células de músculo estriado son componentes muy estables del aparato contráctil. Sin embargo, los filamentos de miosina II más pequeños que se forman en la mayor parte de las células extramusculares a menudo muestran una construcción transitoria, se ensamblan cuando y donde se necesitan para desarmarse después de actuar.

Miosinas no convencionales

En 1973 Thomas Pollard y Edward Korn, de los National Institutes of Health, describieron una proteína única similar a la miosina que extrajeron del protista Acanthamoeba. A diferencia de la miosina muscular, esta miosina no convencional más pequeña era incapaz de ensamblar filamentos in vitro. La proteína recibió el nombre de miosina I. Como se advierte en el esquema de una microvellosidad en la figura 9.66, la miosina I actúa como un “enlace” entre los filamentos de actina del citoesqueleto y la bicapa lípida de la membrana plasmática. Se ha sugerido que dicha forma de miosina ejerce tensión sobre la membrana plasmática, lo cual podría intervenir en fenómenos que requieren movimiento o deformación de la membrana.

Ninguna de las miosinas no convencionales es capaz de formar filamentos, y en vez de ello, al parecer actúan predominantemente como molécula proteínica individual. Las miosinas no convencionales mejor estudiadas pueden desplazarse en forma progresiva por los filamentos de actina en una manera similar a como lo hacen las cinesinas y la dineína citoplásmica al desplazarse por los microtúbulos. Las fases que sigue una de las miosinas, la miosina V, han sido reveladas en una serie extraordinaria de micrografías de fuerza atómica que captan el desplazamiento rápido de una sola molécula a lo largo de una sola molécula de actina (fig. 9.52b). Para visualizar los pasos del ciclo mecánico de la proteína, los investigadores colocaron obstáculos moleculares en la vía de la proteína motora en movimiento, lo cual lentificó la velocidad con lo cual podría desplazarse la proteína. La figura 9.52b incluye una serie de imágenes que revelan los movimientos de la molécula durante un solo ciclo mecánico. (No hay que olvidar que la miosina V normalmente tiene un segmento caudal importante como se muestra en la figura 9.52c, que ha sido eliminado de estos experimentos particulares.)

En la primera toma de la figura 9.52b se advierte que ambas cabezas de la proteína dimérica quedan unidas al filamento subyacente y se identifica un cúmulo de obstáculos en la vía de la proteína motora. En el segundo cuadro, se ha desprendido del filamento la cabeza de la molécula de miosina V que se desplaza y está en el proceso de movimiento anterógrado a través de los obstáculos en su camino. En el cuarto cuadro esta cabeza oscilante entró en contacto con el filamento en una posición anterógrada dentro del mismo, y de este modo se ha transformado en la cabeza delantera. Las imágenes en cuestión permiten la confirmación visual de que la miosina V sigue una trayectoria de “elevación vertical sucesiva” (mano sobre mano) semejante a la que sigue a la molécula de cinesina en el esquema de la figura 9.15b. Para lograr este tipo de movimientos cuando menos una de las dos cabezas debe estar unida en todo momento a su “trayecto” polarizado. La figura 9.52c es una ilustración de la molécula intacta de miosina V. En tal esquema se destaca la miosina V a todo lo largo de cada cuello que es de 23 nm, es decir, unas tres veces mayor que el de la miosina II.

Por tener cuello largo que actúa como prolongaciones oscilantes (o palancas) durante el movimiento, la miosina V puede desplazarse tramos muy grandes, situación de gran importancia en el caso de una proteína motora que se desplaza en forma progresiva siguiendo un filamento de actina compuesto de cordones (helicoidales) de subunidades. La hélice de actina se repite cada trece subunidades (36 nm) que, en promedio, es el tamaño de un tramo de la molécula de miosina V (fig. 9.52b).

Para lograr este tipo de movimiento, cada cabeza de miosina debe moverse una distancia de 72 nm, dos veces la distancia entre dos sitios de unión sucesivos en el filamento de actina (fig. 9.52b). Como resultado de estos pasos gigantes, la miosina V puede caminar sobre el filamento en línea recta, aunque la “carretera” subyacente gire 360° entre sus “pies”.

Varias miosinas no convencionales (entre ellas las miosinas I, V y VI) se asocian con diversos tipos de vesículas citoplásmicas y organelos. En algunos casos las miosinas comentadas actúan más bien como inmovilizadoras de organelos, y en otros casos, como transportadoras de los mismos. Algunas vesículas contienen motores basados en microtúbulos (cinesinas o dineína citoplásmica, o ambas) y motores basados en microfilamentos (miosinas no convencionales); de hecho, los dos tipos de motores pueden vincularse físicamente entre sí. El movimiento de las vesículas y otros portadores membranosos a largas distancias dentro de células animales ocurre sobre los microtúbulos, como se describió antes. Sin embargo, una vez que se aproximan al extremo del microtúbulo, se cree que estas vesículas membranosas a menudo se cambian a los rieles de microfilamentos para efectuar el movimiento local por medio de las miosinas en la periferia celular rica en actina (fig. 9.53).

La cooperación entre microtúbulos y microfilamentos está mejor estudiada en las células pigmentarias (fig. 9.53). En los mamíferos, los gránulos de pigmento (melanosomas) se transportan hacia procesos periféricos finos de la célula pigmentaria mediante una de las isoformas de la miosina V llamada Va. Luego los melanosomas se transfieren a los folículos pilosos donde se incorporan en un pelo en desarrollo. Los ratones que carecen de actividad de miosina Va son incapaces de transferir melanosomas a los folículos pilosos, lo que determina que su pelaje tenga un color mucho más claro. Los seres humanos que no poseen un gen normal que codifica la miosina Va sufren un raro trastorno denominado síndrome de Griscelli; estas personas tienen albinismo parcial (falta de coloración en la piel) y sufren otros síntomas que se consideran relacionados con los defectos en el transporte de vesículas. En el año 2000 se descubrió que un subgrupo de pacientes con síndrome de Griscelli tenía un gen normal para miosina Va, pero carecían de un gen funcional que codificara una proteína periférica de membrana llamada Rab27a. La familia Rab de proteínas se estudió en la página 302 como moléculas que regulan el tránsito vesicular. Ahora parece que las proteínas Rab también participan en la unión de los motores de miosina (y cinesina) con las superficies de membrana (fig. 9.52c).

Las células pilosas, cuya estructura se muestra en la figura 9.54a, han constituido un sistema especialmente adecuado para estudiar las funciones de las miosinas no convencionales. Se llaman así por el paquete de estereocilios rígidos, similares a pelos que se proyectan desde la superficie apical de la célula hacia la cavidad del oído interno, se llena de líquido. El desplazamiento de los estereocilios por los estímulos mecánicos conduce a la abertura de conductos de Ca²⁺ en la membrana lo que genera impulsos nerviosos que se perciben como sonidos. Los estereocilios carecen de relación con los cilios verdaderos expuestos antes. En vez de contener microtúbulos, cada estereocilio es sostenido por un paquete de filamentos de actina paralelos (fig. 9.54b), cuyos extremos barbados se localizan en la punta externa de la proyección y cuyos extremos aguzados se encuentran en la base. Los estereocilios han proporcionado algunas de las imágenes más impresionantes de la naturaleza dinámica del citoesqueleto de actina. Mientras que los estereocilios en sí son estructuras permanentes, los paquetes de actina se encuentran en flujo constante. Continuamente se unen monómeros de actina al extremo barbado de cada filamento, recorren el cuerpo del filamento y se disocian del extremo aguzado. Este proceso se captura en la micrografía de fluorescencia de la figura 9.54c, que muestra la incorporación de subunidades de actina marcadas con GFP en el extremo barbado de cada filamento. Varias miosinas no convencionales (I, III, V, VI, VII y XV) se localizan en diversos sitios del interior de las células pilosas del oído interno; dos de ellas se muestran en la figura 9.54d y e. Las mutaciones en la miosina VIIa son la causa del síndrome de Usher tipo 1B, que se caracteriza por sordera y ceguera. La figura 9.54f,g muestra los efectos morfológicos de las mutaciones en el gen de la miosina VIIa de las células pilosas del oído interno del ratón. Como sucede en los seres humanos, los ratones homocigotos para el alelo mutante que codifica esta proteína motora son sordos.

La miosina VI, un transportador de organelos en el citoplasma de muchas células, se distingue por su movimiento en “reversa”; o sea, hacia el extremo puntiagudo (menos) de un filamento de actina. La miosina VI se localiza en la base de los estereocilios donde conecta el citoesqueleto con la membrana plasmática que lo cubre. En otros tipos de células se piensa que la miosina VI participa en la formación de vesículas recubiertas de clatrina en la membrana plasmática, en el desplazamiento de vesículas sin cubierta hasta los endosomas tempranos, y en la conservación de la morfología del aparato de Golgi. Las mutaciones en la miosina VI son causa de varias enfermedades hereditarias.

Ahora que se describieron los puntos básicos de la estructura y la función de la actina y la miosina puede explicarse cómo interactúan estas dos proteínas para realizar una actividad celular compleja.

Los músculos esqueléticos (estriados) obtienen su nombre del hecho de que la mayor parte de ellos está anclada a los huesos que mueven. Se encuentran bajo el control voluntario y pueden contraerse mediante órdenes conscientes. Las células de músculo estriado tienen una estructura muy poco ortodoxa. Una sola célula muscular cilíndrica suele medir 10 a 100 μm de grueso, más de 100 mm de largo y contiene cientos de núcleos. A causa de estas propiedades, sería más apropiado llamar fibra muscular a estas células. Las fibras musculares tienen muchos núcleos porque cada una es producto de la fusión de grandes cantidades de mioblastos mononucleares (células premusculares) en el embrión.

Es posible que las células de músculo estriado tengan la estructura interna más ordenada de cualquier célula del cuerpo. Un corte longitudinal de una fibra muscular (fig. 9.55) revela un cable formado por cientos de hebras cilíndricas más delgadas, llamadas miofibrillas. Cada miofibrilla consiste en un conjunto lineal repetido de unidades contráctiles, llamadas sarcómeras. A su vez cada sarcómera tiene un patrón de bandas característico que confiere a la fibra muscular su apariencia estriada. El examen de fibras musculares teñidas y observadas bajo el microscopio electrónico muestra que el patrón de bandas es resultado de la superposición parcial de dos tipos distintos de filamentos: filamentos delgados y filamentos gruesos (fig. 9.56a). Cada sarcómera se extiende de una línea Z a la siguiente línea Z y contiene varias bandas oscuras y zonas claras. Una sarcómera tiene un par de bandas I claras localizadas en los bordes externos, una banda A más oscura ubicada entre las bandas I externas y una zona H de tinción clara que se encuentra en el centro de la banda A. Se observa una línea M oscura en el centro de la zona H. La banda I contiene sólo filamentos delgados y la zona H sólo filamentos gruesos; las partes de la banda A que están a ambos lados de la zona H representan la región de superposición y contienen ambos tipos de filamentos.

Los cortes transversales a través de la región de superposición muestran que los filamentos delgados se organizan en un conjunto hexagonal alrededor de cada filamento grueso y que cada filamento delgado se sitúa entre dos filamentos gruesos (fig. 9.56b). Los cortes longitudinales revelan la presencia de proyecciones de los filamentos gruesos a intervalos regulares. Las proyecciones representan puentes capaces de formar uniones con los filamentos delgados vecinos.

El modelo de filamento deslizante de la contracción muscular

Todos los músculos estriados operan por acortamiento; no hay otra forma en que puedan realizar un trabajo. Las unidades de acortamiento son las sarcómeras, cuya disminución de longitud combinada explica el acortamiento del músculo completo. El indicio más importante del mecanismo subyacente de la contracción muscular provino de observaciones del patrón de bandas de las sarcómeras en diferentes etapas del proceso contráctil. Cuando una fibra muscular se acorta, la banda A de cada sarcómera conserva una longitud constante, en tanto las bandas H e I disminuyen de anchura y luego desaparecen del todo. Conforme el acortamiento aumenta, las líneas Z de ambos extremos de la sarcómera se mueven hacia adentro hasta que tocan los bordes externos de la banda A (fig. 9.57).

Con base en estas observaciones, dos grupos de investigadores británicos, Andrew Huxley y Rolf Niedergerke, y Hugh Huxley y Jean Hanson, propusieron en 1954 un modelo de gran alcance para explicar la contracción muscular. Postularon que el acortamiento de las sarcómeras individuales no se debía al acortamiento de los filamentos, sino al deslizamiento de unos sobre otros. El deslizamiento de los filamentos delgados hacia el centro de la sarcómera produciría el aumento observado en la superposición de los filamentos y la disminución en la anchura de las bandas I y H (fig. 9.57). El modelo de filamento deslizante se aceptó en poco tiempo y la evidencia a su favor aún continúa en aumento.

Composición y organización de los filamentos gruesos y delgados

Además de la actina, los filamentos delgados de un músculo estriado contienen otras dos proteínas, tropomiosina y troponina (fig. 9.58). La tropomiosina es una molécula alargada (de unos 40 nm de largo) que se ajusta con firmeza en las hendiduras dentro del filamento delgado. Cada molécula cilíndrica de tropomiosina se relaciona con siete subunidades de actina a lo largo del filamento delgado (fig. 9.58). La troponina es un complejo proteínico globular formado por tres subunidades, cada una con una participación importante y distinta en la función general de la molécula. Las moléculas de troponina están dispuestas con una distancia aproximada de 40 nm entre ellas sobre el filamento delgado y establecen contacto con la actina y la tropomiosina del filamento. Los filamentos de actina de cada media sarcómera están alineados con sus extremos barbados unidos con la línea Z.

Cada filamento grueso está compuesto por varios cientos de moléculas de miosina II junto con pequeñas cantidades de otras proteínas. Al igual que los filamentos que se forman in vitro (véase fig. 9.51), la polaridad de los filamentos gruesos de las células musculares se invierte en el centro de la sarcómera. El centro del filamento se forma con las regiones de la cola de las moléculas de miosina opuestas y carece de cabezas. Las cabezas de miosina sobresalen de cada filamento grueso en todo el resto de su extensión por la posición intercalada de las moléculas de miosina que componen el cuerpo del filamento (fig. 9.51).

La tercera proteína más abundante en los músculos estriados de los vertebrados es la titina, que es la proteína más grande descubierta en cualquier organismo. Todo el gen de titina (que puede dar lugar a isoformas de distinta longitud) codifica un polipéptido con masa molecular mayor de 3.5 millones de Da y que contiene más de 38 000 aminoácidos. Las moléculas de titina se originan en la línea M del centro de cada sarcómera y se extienden a lo largo del filamento de miosina, continúan después de la banda A y terminan en la línea Z (fig. 9.59). La titina es una proteína muy elástica que se estira como una liga cuando ciertos dominios dentro de la molécula se desenrollan. Se cree que la titina previene la rotura de la sarcómera durante el estiramiento muscular. También mantiene los filamentos de miosina en su posición apropiada al interior del centro de la sarcómera durante la contracción muscular.

Base molecular de la contracción

Después de la formulación de la hipótesis del filamento deslizante, la atención se dirigió a las cabezas de las moléculas de miosina como los componentes generadores de fuerza de la fibra muscular. Durante una contracción cada cabeza de miosina se extiende hacia fuera y se une con firmeza al filamento delgado, con lo que se forman los puentes que se ven entre los dos tipos de filamentos (fig. 9.57). Las cabezas de un solo filamento de miosina interactúan con seis filamentos de actina circundantes. Mientras permanece unida con fuerza al filamento de actina, la cabeza de miosina sufre un cambio en la conformación (descrito más adelante) que mueve el filamento delgado de actina unos 10 nm hacia el centro de la sarcómera. A diferencia de la miosina V (que se muestra en la figura 9.52), la miosina muscular (miosina II) es un motor no progresivo. La miosina muscular permanece en contacto con su riel, el filamento delgado, sólo durante una pequeña fracción (menos de 5%) del ciclo completo. Sin embargo, cada filamento delgado entra en contacto con un equipo de casi cien cabezas de miosina que se mueven en forma sincrónica (fig. 9.57a). Por consiguiente, el filamento delgado realiza un movimiento continuo durante cada ciclo contráctil. Se estima que un solo filamento delgado de una célula muscular puede moverse varios cientos de nanómetros durante un intervalo de apenas 50 milisegundos.

Desde hace mucho tiempo los expertos en fisiología muscular buscan comprender cómo una sola molécula de miosina puede mover el filamento de actina unos 10 nm en un solo consumo de energía. La publicación de la primera estructura atómica del fragmento S1 de la miosina II realizada en 1993 por Ivan Rayment, Hazel Holden y colaboradores, de la Wisconsin University enfocaron la atención en una propuesta para explicar este mecanismo de acción. En esta hipótesis, la energía liberada por la hidrólisis del ATP induce un pequeño cambio en la conformación (0.5 nm) dentro de la cabeza mientras aún permanece unida con fuerza al filamento de actina. El pequeño movimiento dentro de la cabeza se amplifica después unas 20 veces con el balanceo del cuello helicoidal alfa adyacente (fig. 9.60). De acuerdo con esta hipótesis, el cuello alargado de la miosina II actúa como una “palanca rígida”, lo que hace que el filamento de actina unido se deslice una distancia mucho mayor de la que sería posible de cualquier otra manera. Se cree que las dos cadenas ligeras, que se enredan alrededor del cuello, confieren rigidez a la palanca.

El apoyo para la idea del “brazo de palanca” al principio se obtuvo de una serie de experimentos efectuados por James Spudich y colaboradores, en la Stanford University. Estos investigadores construyeron genes que codificaban versiones alteradas de la molécula de miosina II, las cuales contenían cuellos de distintas longitudes. Luego las moléculas de miosina modificadas por ingeniería genética se probaron en un ensayo in vitro con filamentos de actina, similar a la prueba mostrada en la figura 9.50. Como se esperaba con base en la hipótesis del brazo de palanca, la longitud aparente por cada consumo de energía de las moléculas de miosina resultó directamente proporcional a la longitud de sus cuellos. Las moléculas de miosina con cuellos más cortos generaron desplazamientos más cortos, mientras que aquellas con cuello más largo produjeron un desplazamiento mayor. No todos los estudios apoyan la relación entre el tamaño del paso y la longitud del cuello, por lo que la función del brazo de palanca aún es tema de controversia.

Energética del deslizamiento del filamento

Como las otras proteínas motoras cinesina y dineína, la miosina convierte la energía química del ATP en la energía mecánica del deslizamiento de un filamento. Cada ciclo de actividad mecánica del puente de miosina tarda unos 50 ms y se acompaña de un ciclo de actividad de la ATPasa, como se ilustra en el modelo de la figura 9.61. Según este modelo, el ciclo comienza cuando una molécula de ATP se une con la cabeza de miosina, un fenómeno que induce la disociación del puente con el filamento de actina (fig. 9.61, paso 1). La unión del ATP va seguida por su hidrólisis, que ocurre antes que la cabeza de miosina establezca contacto con el filamento de actina. Los productos de la hidrólisis del ATP, o sea ADP y P_i, permanecen unidos al sitio activo de la enzima, mientras la proteína completa absorbe la energía liberada por la hidrólisis (fig. 9.61, paso 2). En este momento el puente se halla en estado energético, análogo a un resorte estirado capaz de realizar un movimiento espontáneo. La miosina cargada de energía se une con la molécula de actina (paso 3) y libera el fosfato unido, lo que desencadena un gran cambio en la conformación impulsado por la energía libre que estaba almacenada (paso 4). Este cambio en la conformación mueve el filamento de actina hacia el centro de la sarcómera. Tal movimiento representa el pulso de energía de la cabeza de miosina que se muestra en la figura 9.60. A la liberación del ADP unido (paso 5) le sigue la unión de una nueva molécula de ATP para que un nuevo ciclo pueda iniciarse. En ausencia de ATP la cabeza de miosina permanece unida con fuerza al filamento de actina. La incapacidad de los puentes de miosina para desprenderse en ausencia de ATP es la base de la condición conocida como rigor mortis, la rigidez de los músculos que sigue a la muerte.

Acoplamiento de la excitación-contracción

Las fibras musculares se organizan en grupos llamados unidades motoras. Todas las fibras de una unidad motora están inervadas por ramas de una sola neurona motora y se contraen en forma simultánea cuando reciben el estímulo de un impulso transmitido por esa neurona. El punto de contacto del extremo de un axón con una fibra muscular se llama unión neuromuscular (fig. 9.62; véase también la figura 4.56 para obtener una imagen más cercana de la estructura de la sinapsis). La unión neuromuscular es un sitio de transmisión del impulso nervioso del axón, a través de la hendidura sináptica y hasta la fibra muscular, cuya membrana plasmática también es excitable y capaz de conducir un potencial de acción.

Los pasos entre la llegada de un impulso nervioso a la membrana plasmática muscular y el acortamiento de las sarcómeras en la profundidad de la fibra muscular constituyen un proceso que se conoce como acoplamiento de excitación-contracción. A diferencia de una neurona, en la que el potencial de acción permanece en la superficie celular, el impulso generado en una célula de músculo estriado se propaga al interior de la célula por los pliegues membranosos llamados túbulos transversos (T) (fig. 9.62). Los túbulos T terminan muy cerca de un sistema de membranas citoplásmicas que conforman el retículo sarcoplásmico (SR), que forma una manga membranosa alrededor de la miofibrilla. Cerca de 80% de la proteína integral de la membrana del SR consiste en moléculas de ATPasa-Ca²⁺ cuya función es transportar el calcio fuera del citosol y hacia la luz del SR, donde se almacena hasta que se necesite.

La importancia del calcio en la contracción muscular se demostró por primera vez en 1882, cuando Sydney Ringer, un médico inglés, quién encontró que el corazón aislado de una rana se contraía en solución salina preparada con agua corriente de Londres, pero no sucedía lo mismo en una solución preparada con agua destilada. Ringer estableció que los iones de calcio presentes en el agua corriente eran un factor esencial en la contracción muscular. Los niveles de calcio dentro del citoplasma de una fibra muscular son muy bajos (alrededor de 2 × 10^–7M) en el estado relajado, menores a la concentración umbral necesaria para la contracción. Con la llegada de un potencial de acción a través de los túbulos transversos, los conductos de calcio de la membrana del SR se abren y el calcio sale del compartimiento del SR y recorre la corta distancia hasta las miofibrillas. Como resultado los niveles intracelulares de Ca²⁺ se elevan a cerca de 5 × 10^–5 M. Para comprender el modo en que los niveles altos de calcio desencadenan la contracción en una fibra de músculo estriado es necesario reconsiderar la estructura proteínica de los filamentos delgados.

Cuando la sarcómera está relajada, las moléculas de tropomiosina de los filamentos delgados (véase fig. 9.58) bloquean los sitios de unión de la miosina en las moléculas de actina. La posición de la tropomiosina dentro de la hendidura está bajo el control de la molécula de troponina unida. Cuando los niveles de calcio se elevan, estos iones se unen con una de las subunidades de troponina (troponina C) e inducen un cambio en la conformación en otra subunidad de la molécula de troponina. Como el colapso de una torre de fichas de dominó, el movimiento de la troponina se transmite a la tropomiosina adyacente, que se acerca unos 1.5 nm al centro de la hendidura del filamento (de la posición b a la posición a en la figura 9.63). Este cambio en la posición de la tropomiosina expone los sitios de unión para miosina en las moléculas adyacentes de actina. Cada molécula de troponina controla la posición de una molécula de tropomiosina, que a su vez regula la capacidad de unión de siete subunidades de actina en el filamento delgado.

Una vez que la estimulación de la fibra nerviosa motora cesa, los conductos de calcio de la membrana del SR se cierran y las moléculas de Ca²⁺-ATPasa de esa membrana retiran el exceso de calcio del citosol. Conforme la concentración de Ca²⁺ disminuye, estos iones se separan de sus sitios de unión en la troponina, lo que ocasiona que las moléculas de tropomiosina regresen a una posición en la que bloquean la interacción entre actina y miosina. El proceso de relajación puede considerarse una competencia por el calcio entre la proteína de transporte de la membrana del SR y la troponina. La proteína de transporte tiene una mayor afinidad por el ion, por lo que la tendencia se dirige a retirar el calcio del citosol y dejar las moléculas de troponina sin calcio unido.

Las células de músculo estriado son un sistema ideal para el estudio de la contractilidad y el movimiento porque las proteínas que interactúan están presentes en altas concentraciones y son parte de estructuras celulares definidas. El estudio de la movilidad en otros tejidos diferentes al músculo (no muscular) es más desafiante porque los componentes tienden a encontrarse en formas menos ordenadas, más lábiles y transitorias. Aún más, casi siempre se limitan a una corteza delgada justo debajo de la membrana plasmática. La corteza es una región activa de la célula, encargada de procesos como la ingestión de materiales extracelulares, la extensión de prolongaciones durante el movimiento celular y la constricción de una sola célula animal en dos células hijas durante la división celular. Todos estos procesos dependen del ensamble de microfilamentos en la corteza.

En las páginas siguientes se presentan varios ejemplos de contractilidad y motilidad extramusculares que dependen de filamentos de actina y, en algunos casos, de miembros de la superfamilia de la miosina. Sin embargo, primero es importante revisar los factores que regulan la velocidad de ensamble, la cantidad, la longitud y los patrones espaciales de los filamentos de actina.

Proteínas de unión con la actina

La actina purificada puede polimerizarse in vitro para formar filamentos de actina, pero estos filamentos no pueden interactuar entre sí ni realizar actividades útiles. Bajo el microscopio se parecen al piso de un granero cubierto con paja. En cambio, los filamentos de actina de las células vivas se organizan en varios patrones, inclusive varios tipos de haces, redes delgadas (bidimensionales) y gelatinas tridimensionales complejas (fig. 9.64). La organización y comportamiento de los filamentos de actina dentro de las células depende de una gran variedad de proteínas de unión con actina que influyen en el ensamble y desensamble localizados de los filamentos de actina, sus propiedades físicas y sus interacciones entre sí y con los organelos celulares. Se han aislado más de 100 proteínas diferentes de unión con actina que pertenecen a muchas familias en varios tipos celulares. Las proteínas de unión con actina pueden dividirse en varias categorías según su presunta función en la célula (fig. 9.65).⁵

1. Proteínas de nucleación. El paso más lento en la formación de un filamento de actina es el primero, la nucleación, que requiere la unión de por lo menos dos o tres monómeros de actina en la orientación apropiada para iniciar la formación del polímero. Este es un proceso muy poco favorable si se dejan solas a las moléculas de actina. Como se mencionó antes, la formación de un filamento de actina se acelera en presencia de una semilla o núcleo preexistente al que puedan agregarse monómeros (como en la figura 9.47a). Se han identificado varias proteínas que promueven la nucleación de filamentos de actina. La mejor estudiada es el complejo Arp2/3, que contiene dos “proteínas relacionadas con actina”, esto es, proteínas que comparten considerable homología de secuencia con las actinas, pero no se consideran actinas “verdaderas”. Una vez que se activa el complejo, los dos Arp adoptan una conformación que conforma una plantilla a la que pueden agregarse monómeros de actina, análogo a la forma en que se propone que la tubulina γ forme una plantilla para la nucleación del microtúbulo (fig. 9.20c). Como se expone en la página 378, el complejo Arp2/3 genera redes de filamentos de actina ramificados cortos. Otra proteína de nucleación, llamada formina, genera filamentos no ramificados, como los que se hallan en adhesiones focales (pág. 248) y en los anillos contráctiles de células en división (sección 14.2). A diferencia de Arp2/3, que permanece en el extremo aguzado del filamento recién formado, la formina sigue el extremo barbado incluso cuando se insertan unidades nuevas en ese sitio. Por todo lo expuesto, no solamente las forminas generan núcleos de filamentos de actina sino que inducen lña elongación rápida de los mismos en cuya creación intervinieron.

2. Proteínas para secuestro de monómeros. Las timosinas (p. ej., timosina-β₄) son proteínas que se unen con los monómeros actina-ATP (a menudo llamada actina G) e impiden la polimerización. Las proteínas con esta actividad se describen como proteínas que secuestran monómeros de actina. Se cree que son las encargadas de mantener la concentración relativamente alta de actina G en células no musculares (50 a 200 mM). Sin las proteínas que secuestran monómeros, las condiciones en el citoplasma favorecerían la polimerización casi completa de los monómeros solubles de actina en filamentos. A causa de su capacidad para unirse con actina G y estabilizar la reserva de monómeros, los cambios en la concentración o la actividad de las proteínas que secuestran monómeros puede modificar el equilibrio entre monómeros y polímeros en cierta región de una célula y determinar si en un momento determinado se favorece la polimerización o la despolimerización.

3. Proteínas bloqueadoras de los extremos (tapas). Las proteínas de este grupo regulan la longitud de los filamentos de actina al unirse con uno u otro extremo de los filamentos, formando una tapa que bloquea tanto la pérdida como la ganancia de subunidades. Si el extremo barbado de crecimiento rápido de un filamento se bloquea, la despolimerización puede proceder en el extremo contrario, lo que conduce al desensamble del filamento. Si el extremo afilado también se tapa, la despolimerización se bloquea. Los filamentos delgados de músculo estriado se tapan en su extremo barbado en la línea Z por una proteína llamada capZ y en su extremo afilado lo hacen con la proteína tropomodulina. Si la tapa de tropomodulina se altera con la microinyección de anticuerpos en una célula muscular, los filamentos delgados agregan más subunidades de actina en su extremo puntiagudo recién expuesto y experimentan una elongación drástica en la parte intermedia de la sarcómera.

4. Proteínas polimerizadoras de monómero. La profilina es una pequeña proteína que se une en el mismo sitio de un monómero de actina que la timosina. Sin embargo, en lugar de inhibir la polimerización, la profilina fomenta el crecimiento de los filamentos de actina. La profilina lo hace mediante la unión con un monómero de actina, donde cataliza la disociación del ADP unido, que se sustituye en poco tiempo con un ATP. El monómero profilina-ATP-actina puede entonces ensamblarse sobre el extremo barbado libre de un filamento de actina, lo que conduce a la liberación de profilina. La elongación del filamento en el extremo “barbado” es estimulado todavía más por los miembros de la familia de proteínas Ena/VASP.

5. Proteínas despolimerizadoras del filamento de actina. Los miembros de la familia proteica de la cofilina (que incluye cofilina, ADF y depactina) se unen con las subunidades actina-ADP presentes en el cuerpo y en el extremo afilado de los filamentos de actina (fig. 18.33). La cofilina tiene dos actividades evidentes: puede fragmentar los filamentos de actina y puede promover su despolimerización en el extremo afilado. Estas proteínas participan en el recambio rápido de los filamentos de actina en sitios de cambios dinámicos de la estructura del citoesqueleto. Son esenciales para la locomoción celular, la fagocitosis y la citocinesis.

6. Proteínas que forman enlaces cruzados. Las proteínas de este grupo pueden alterar la organización tridimensional de una población de filamentos de actina. Cada una de estas proteínas tiene dos o más sitios de unión con actina, por lo que pueden establecer enlaces entre dos o más filamentos de actina separados. Algunas de estas proteínas (p. ej., la filamina) tienen la forma de un cilindro largo y flexible y promueven la formación de redes laxas de filamentos interconectados entre sí en ángulos casi rectos (como en la figura 9.64). Las regiones del citoplasma que contienen estas redes poseen las propiedades de un gel elástico tridimensional que resiste las presiones mecánicas locales. Otras proteínas que forman enlaces (p. ej., vilina y fimbrina) tienen forma globular y promueven el agrupamiento de filamentos de actina en conjuntos paralelos muy ajustados. Estas estructuras se encuentran en las microvellosidades que se proyectan de ciertas células epiteliales (fig. 9.66) y en los estereocilios parecidos a pelos (fig. 9.54) que sobresalen de las células receptoras del oído interno. La agrupación de filamentos aumenta su rigidez, lo que les permite actuar como un esqueleto interno de soporte para estas proyecciones citoplásmicas.

7. Proteínas cortadoras de filamentos. Las proteínas de esta clase tienen la capacidad para unirse con un lado de un filamento ya formado y romperlo en dos. Las proteínas cortadoras (p. ej., la gelsolina) también pueden favorecer la incorporación de monómeros de actina mediante la creación de más extremos barbados libres, aunque también es posible que tapen los extremos que generan. Como se indica en la figura 9.71, la cofilina también es capaz de cortar filamentos.

8. Proteínas de unión con membrana. Gran parte de la maquinaria contráctil de las células no musculares radica justo debajo de la membrana plasmática. Durante muchas actividades, las fuerzas generadas por las proteínas contráctiles actúan sobre la membrana plasmática y hacen que sobresalga (como ocurre, por ejemplo, durante la locomoción celular) o que se invagine (como sucede durante la fagocitosis o la citocinesis). Por lo general estas actividades se facilitan por la unión indirecta de los filamentos de actina con la membrana plasmática mediante el enlace con una proteína periférica de membrana. En capítulos previos se describieron dos ejemplos: la inclusión de polímeros cortos de actina en el esqueleto de la membrana de los eritrocitos (véase fig. 4.32d) y la unión de los filamentos de actina con la membrana en las adhesiones focales y las uniones adherentes (véanse figs. 7.17 y 7.26). Las proteínas que unen las membranas con la actina comprenden la vinculina, miembros de la familia ERM (ezrina, radixina y moesina) y miembros de la familia de la espectrina (inclusive la distrofina, la proteína cuyo defecto causa la distrofia muscular).

Ejemplos de movilidad y contractilidad no muscular

Los filamentos de actina, que a menudo trabajan en conjunto con los motores de miosina, son los encargados de varias actividades dinámicas en las células extramusculares, como la fagocitosis, la formación de corrientes citoplásmicas (flujo dirigido de citoplasma que ocurre en ciertas células vegetales grandes), el tráfico de vesículas, la activación de plaquetas, los movimientos laterales de proteínas integrales dentro de las membranas, las interacciones entre célula y sustrato, la locomoción celular, el crecimiento axónico y los cambios en la forma celular. Los ejemplos siguientes ilustran la motilidad y la contractilidad no musculares.

Polimerización de la actina como mecanismo generador de fuerza

Algunos tipos de motilidad celular ocurren sólo como resultado de la polimerización de la actina y no implican actividad de la miosina. Considérese el ejemplo de Listeria monocytogenes, una bacteria que infecta los macrófagos y puede causar encefalitis o intoxicación alimentaria. Listeria se impulsa como un cohete por el citoplasma de una célula infectada mediante la polimerización de monómeros de actina justo detrás de la bacteria (fig. 9.67). ¿Cómo puede esta bacteria inducir la formación de filamentos de actina en un sitio particular de su superficie? Las preguntas respecto a la localización son importantes en el estudio de cualquier tipo de proceso móvil porque la movilidad depende de que una célula sea capaz de ensamblar la maquinaria necesaria en un sitio y momento particulares. Listeria puede realizar esta hazaña porque contiene una proteína llamada ActA que sólo se encuentra en un extremo de la bacteria. Cuando ActA queda expuesta dentro del citoplasma del huésped, recluta y activa varias proteínas del huésped (inclusive el complejo Arp2/3 descrito antes) que trabajan juntas para dirigir el proceso de polimerización de actina. El proceso de propulsión de Listeria se reconstruyó in vitro y ello permitió a los investigadores demostrar de manera concluyente que la polimerización de la actina por sí misma, sin la participación de motores de miosina, puede brindar la fuerza necesaria para la movilidad.

Los mismos fenómenos que ocurren durante la propulsión de la Listeria se utilizan en las actividades celulares normales; van desde la propulsión de vesículas citoplásmicas y organelos hasta el movimiento de las células mismas, que es el tema de la sección siguiente.

Locomoción celular

La locomoción celular es necesaria para muchas actividades en los vertebrados superiores, inclusive el desarrollo de tejidos y órganos, la formación de vasos sanguíneos, el desarrollo de axones, la cicatrización de heridas y la protección contra infecciones. La locomoción celular también es la encargada de la diseminación de tumores cancerosos. La siguiente descripción se concentra en los estudios de células cultivadas que se mueven sobre un sustrato plano (bidimensional) porque estas son las condiciones experimentales que dominan este campo de investigación. Hay que tener presente que las células del cuerpo no se mueven sobre sustratos desnudos y planos y que cada vez se tiene más evidencia de que algunos de los hallazgos de estos estudios tal vez no se apliquen a las células que cruzan un terreno más complicado. Hace poco, los investigadores comenzaron a desarrollar sustratos más complejos, incluidos varios tipos de matrices extracelulares tridimensionales (fig. 18.22), lo que podría conducir a la revisión de algunos de los aspectos del mecanismo de locomoción celular explicado a continuación.

La figura 9.68 muestra un solo fibroblasto que se encontraba en el proceso de moverse hacia la esquina inferior derecha del campo cuando se preparó para el examen microscópico. La locomoción celular, como la que muestra el fibroblasto de la figura 9.68, comparte propiedades con otros tipos de locomoción, como la marcha. Cuando una persona camina, el cuerpo realiza una serie de actividades repetitivas: primero, se extiende una pierna en la dirección de la locomoción; segundo, la planta del pie hace contacto con el suelo, que actúa como punto de adhesión transitoria; tercero, los músculos de las piernas generan fuerza que mueven todo el cuerpo hacia adelante, más allá del pie estacionario, al mismo tiempo que genera tracción contra el punto de adhesión; cuarto, el pie, que ahora está detrás del cuerpo y no al frente, se levanta del piso como anticipación al siguiente paso. Aunque las células móviles puedan asumir formas muy distintas mientras se arrastran sobre el sustrato, presentan una secuencia similar de actividades (fig. 9.69). (1) El movimiento inicia por la protrusión de una parte de la superficie celular en la dirección en la que la célula va a moverse. (2) Una parte de la superficie inferior de la protrusión se adhiere al sustrato y forma sitios de anclaje temporal. (3) La mayor parte de la célula se impulsa al frente sobre los contactos adhesivos, que al final se convierten en la parte posterior de la célula. (4) La célula rompe los contactos traseros con el sustrato, lo que causa la retracción del margen final o “cola”.

Células que se arrastran sobre el sustrato Cuando un pequeño fragmento de tejido vivo, como la piel o el hígado, se coloca en una caja de cultivo con medio de cultivo adecuado, algunas células individuales emigran del espécimen hacia la superficie de la caja. El examen de estas células bajo el microscopio casi siempre muestra que son fibroblastos, las células predominantes en el tejido conjuntivo (véase fig. 7.1). Conforme se mueve, el fibroblasto se aplana y aproxima mucho al sustrato y adquiere una forma de abanico, con un borde frontal ancho y una “cola” estrecha (véase fig. 9.68). Su movimiento es errático y brusco, a veces avanza y otras se retira. En un buen día un fibroblasto puede avanzar cerca de 1 mm. La clave de la locomoción del fibroblasto se observa cuando se examina su borde frontal, que se extiende como una protrusión ancha, aplanada y semejante a un velo llamada lamelipodio (fig. 9.70a). Por lo general los lamelipodios carecen de vesículas citoplásmicas y otras estructuras en partículas, y a menudo el margen externo tiene un movimiento ondulante, lo que le confiere una apariencia arrugada (fig. 9.70b). Mientras el lamelipodio se extiende de la célula, se adhiere al sustrato subyacente en puntos específicos, lo que le brinda sitios de anclaje temporal para que la célula tire de sí misma hacia adelante.

En la página 374 se vio cómo la polimerización de los monómeros de actina puede brindar la fuerza que impulsa a una bacteria Listeria por el citoplasma. Este tipo de movimiento intracelular se realiza sin la participación de motores moleculares. Se cree que un tipo similar de mecanismo de polimerización de actina provee la fuerza motriz necesaria para la protrusión del borde de avance de un lamelipodio. Este tipo de motilidad no muscular también demuestra la importancia de las proteínas de unión con actina (mostradas en la fig. 9.65) para orquestar el ensamble y desensamble de las redes de filamentos de actina en un sitio particular dentro de la célula en un momento determinado.

Supóngase que se inicia con un leucocito redondeado que recibe una señal química proveniente de un sitio particular en el que el cuerpo está herido. Una vez que el estímulo se recibe en la membrana plasmática, inicia la polimerización localizada de actina, que causa la polarización de la célula y su movimiento hacia la fuente del estímulo (fig. 9.71a).⁶ Tal como Listeria tiene una proteína (ActA) que activa la polimerización en la superficie celular bacteriana, las células de mamífero tienen una familia de proteínas (la familia WASP/WAVE) que activa el complejo Arp2/3 en el sitio de estimulación cerca de la membrana plasmática. WASP, el miembro fundador de la familia, se descubrió como el producto de un gen causante del síndrome de Wiskott-Aldrich. El sistema inmunitario de los pacientes con este trastorno es defectuoso porque sus leucocitos carecen de proteína WASP funcional y por lo tanto, no responden a las señales quimiotácticas.

La figura 9.71b muestra un modelo de los principales pasos en la formación de un lamelipodio que movería una célula en una dirección determinada. Se recibe un estímulo en un extremo de la célula (paso 1, fig. 9.71b) que conduce a la activación de complejos de proteína Arp2/3 por un miembro de la familia de proteínas WASP (paso 2). En su estado activo, el complejo Arp2/3 adopta una conformación parecida a la superficie libre del extremo con puntas del filamento de actina. Como resultado, los monómeros libres de ATP-actina se unen con la plantilla Arp2/3, lo que conduce a la nucleación de los filamentos de actina (paso 3). La polimerización de los monómeros de actina unidos con ATP en los extremos barbados libres del filamento en crecimiento se promueve mediante moléculas de profilina (pág. 373). Una vez que los nuevos filamentos de actina se forman, los complejos Arp2/3 se unen a los lados de estos filamentos (paso 4) y constituyen el núcleo para la formación de filamentos de actina adicionales que se forman como ramas (paso 5). Los complejos Arp2/3 permanecen en los extremos afilados, que se sitúan en los puntos de ramificación. Mientras tanto, la adición de una proteína tapa bloquea el crecimiento de los extremos barbados de los filamentos más antiguos (paso 5). En cambio, la adición de subunidades de actina a los extremos barbados de los filamentos más nuevos de la red empuja la membrana del lamelipodio hacia afuera, en la dirección del estímulo atrayente (pasos 5 y 6). Conforme los nuevos filamentos crecen por la adición de subunidades en sus extremos barbados, los filamentos tapados más antiguos se desensamblan a partir de sus extremos afilados (paso 6). La cofilina promueve el desensamble, ya que se une con las subunidades actina-ADP a lo largo de los filamentos (paso 6). Las subunidades actina-ADP liberadas de los filamentos que se desensamblan se recargan mediante la conversión en monómeros profilina-ATP-actina, que pueden reutilizarse en el ensamble de filamentos de actina en el borde de avance.

La figura 9.72 ilustra algunas de las principales características estructurales de la locomoción celular. La micrografía electrónica de la figura 9.72 muestra la naturaleza ramificada y con puentes cruzados de la red filamentosa de actina que se encuentra justo debajo de la membrana plasmática de un lamelipodio en avance. Los insertos circulares de la figura 9.72 muestran una sucesión de ramas cortas de filamentos de actina, con complejos de Arp2/3 resaltados con una marca inmunitaria de oro. Se observa que los complejos Arp2/3 se encuentran en las uniones con forma de Y en las que los nuevos filamentos polimerizados se ramificaron de los filamentos preexistentes.

El movimiento del lamelipodio es un proceso dinámico. Mientras la polimerización y la ramificación de filamentos de actina continúan en el borde frontal del lamelipodio, los filamentos ensamblados de actina fluyen en dirección retrógrada y después se despolimerizan orientados hacia la porción trasera del lamelipodio (paso 6, fig. 9.71). Por lo tanto, si se considera como un todo, el filamento de actina completo experimenta un tipo de movimiento de cinta sin fin (pág. 360) en el que las subunidades de actina se agregan a los extremos barbados de la estructura en la parte frontal y se pierden de los extremos afilados en la parte posterior.

De acuerdo con la secuencia de fenómenos mostrada en la figura 9.69, a la protrusión del borde de avance la sigue el movimiento de toda la célula. Las principales fuerzas que participan en la locomoción celular son las generadas en los sitios de adhesión que se requieren para jalar o “arrastrar” el cuerpo principal de la célula hacia el frente (paso 3, fig. 9.69). A menudo se describen como “fuerzas de tracción” porque se producen en los sitios en los que la célula se sujeta al sustrato.

Cuando se permite que las células migren sobre una hoja delgada de material elástico, los movimientos de las células se acompañan de deformación del sustrato (véase fig. 7.18). La magnitud de las fuerzas de tracción ejercidas en varios lugares en una célula migratoria viva puede calcularse a partir de los patrones dinámicos de la deformación del sustrato y representarse como se muestra en la figura 9.73a. Como se ve al examinar esta imagen por computadora de un fibroblasto migratorio, las mayores fuerzas de tracción se ejercen justo detrás del borde de avance de la célula, donde ésta se adhiere con firmeza al sustrato subyacente. La presencia de estos sitios de unión se revela mejor si se sigue la localización de la vinculina con marca fluorescente dentro de una célula viva. Esto permite a los investigadores visualizar en forma específica las estructuras donde la célula hace contacto con el sustrato subyacente. La figura 9.73b es una micrografía fluorescente que muestra la presencia de moléculas rojas fluorescentes de vinculina concentradas justo detrás del borde de avance de una célula migratoria. La vinculina es un componente importante de las adhesiones focales, los sitios que contienen actina ilustrados en la figura 7-17. Los sitios que contienen vinculina en los que el borde de avance de una célula migratoria se adhiere al sustrato tienden a ser más pequeños y sencillos que las adhesiones focales maduras que se ven en las células cultivadas estacionarias muy extendidas y a menudo se denominan complejos focales. Se piensa que se generan fuerzas de tracción en el citoesqueleto de actina, vinculado con estos sitios de adherencia, que después son transmitidos al sustrato extracelular por medio de las moléculas de integrina transmembra que conectan las caras interna y externa de la célula. Los complejos focales que se forman cerca del borde conductor de una célula en movimiento se desensamblan conforme la célula se desplaza hacia adelante o maduran en elementos de adherencia focal de mayor tamaño y más contráctiles. Es probable que la maduración de los complejos focales sea estimulada por la tensión que se ejerce en tales sitios de adherencia.

Se dispone de mucha evidencia que indica que la polimerización de la actina es el fenómeno que empuja el borde de avance de una célula hacia afuera (paso 1, fig. 9.69), mientras que la miosina (junto con los filamentos de actina) es la encargada de jalar el resto de la célula hacia el frente (paso 3, fig. 9.69). Estas funciones contrastantes de la actina y la miosina se ilustran mejor en estudios con queratocitos de peces, que son células derivadas de la epidermis que cubre las escamas de los peces. Los queratocitos gozan de aceptación como sistemas para estudiar la locomoción porque su rápido movimiento de deslizamiento depende de la formación de un lamelipodio muy ancho y delgado. La figura 9.74 muestra un queratocito en movimiento que se fijó y tiñó para mostrar la actina (fig. 9.74a) y la miosina II (fig. 9.74b). Como se esperaba con base en la explicación previa, el borde de avance del lamelipodio está lleno de actina. Por otro lado, la miosina se concentra en una banda donde la parte trasera del lamelipodio se une con el resto de la célula. Las micrografías electrónicas de esta región muestran la presencia de cúmulos de pequeños filamentos bipolares de miosina II en la red de actina (fig. 9.74c). Se supone que las fuerzas contráctiles generadas por estas moléculas de miosina tiran del cuerpo celular detrás del lamelipodio conductor. También se cree que la miosina I y otras miosinas no convencionales generan fuerzas para la locomoción celular en algunos organismos.

Crecimiento axónico

Ross Harrison, de la Yale University realizó uno de los experimentos clásicos de la biología en 1907. Harrison retiró un pequeño fragmento de tejido del sistema nervioso en desarrollo de un embrión de rana y lo colocó en una diminuta gota de líquido linfático. Observó el tejido al microscopio durante los días siguientes y encontró que las células nerviosas no sólo permanecían saludables, sino que muchas de ellas desarrollaban procesos que crecían hacia el medio circundante. Esta no sólo fue la primera ocasión en que las células se mantuvieron vivas en un cultivo de tejido, sino que el experimento aportó evidencia importante de que los axones se desarrollan por un proceso de crecimiento y elongación activos.

La punta de un axón que se alarga es distinta del resto de la célula (véase fig. 9.1b). Aunque la mayor parte del axón muestra poca evidencia externa de actividad móvil, la punta, o cono de crecimiento, se parece a un fibroblasto reptante de gran movilidad. Un análisis cuidadoso de un cono de crecimiento vivo revela varios tipos de procesos locomotrices: un lamelipodio aplanado y ancho que se arrastra hacia afuera sobre el sustrato; microespículas cortas y rígidas (fig. 9.75a) que apuntan hacia fuera, al borde del lamelipodio y filopodios muy alargados que se extienden y retraen en una exhibición continua de actividad móvil. La microscopia de fluorescencia muestra que todas estas estructuras en el dominio del cono de crecimiento están llenas de filamentos de actina (ilustrados en verde, fig. 9.75b). Se presume que estos filamentos de actina son los que explican las actividades móviles del cono de crecimiento. Por otro lado, los microtúbulos llenan el axón y el dominio central del cono de crecimiento, lo que brinda soporte al axón delgado que se alarga. Se observa que varios microtúbulos individuales penetran en la periferia rica en actina (mostrada en naranja, fig. 9.75b). Estos microtúbulos penetrantes son muy dinámicos y pueden tener una participación importante en la determinación de la dirección del crecimiento axónico.

El cono de crecimiento es una región muy móvil de la célula que explora su ambiente y alarga el axón. Dentro del embrión, los axones de las neuronas en desarrollo crecen a lo largo de trayectos definidos, siguen ciertos rasgos topográficos del sustrato o responden a la presencia de ciertas sustancias que se difunden en su camino. Los lamelipodios y los filopodios del cono de crecimiento responden a la presencia de estos estímulos físicos y químicos, lo que hace que los axones que buscan el camino se dirijan hacia los factores atrayentes y lejos de los repulsivos. La figura 9.76a muestra una neurona en cultivo cuya punta de avance hace un desvío directo hacia una proteína difusible llamada netrina, que actúa como atrayente para los axones en crecimiento dentro del embrión joven. La figura 9.76b muestra un cono de crecimiento (verde) que establece contacto con una célula que está en fase de expresar otra proteína llamada efrina (en rojo) que también actúa como un factor de guía neuronal. A diferencia de la netrina, la efrina es una proteína integral no difusible de la membrana plasmática que se une a un receptor de ella (efrina) en la superficie del cono de crecimiento. El cono recién mencionado establece contacto con la célula que expresa la efrina por medio de sus filopodios largos que desempeñan una función sensitiva. Al final el cableado correcto de todo el sistema nervioso depende de la asombrosa capacidad de los conos de crecimiento embrionarios para tomar las “decisiones” de dirección correcta que los conducen a los órganos que deben inervar.

Cambios en la forma celular durante el desarrollo embrionario

Cada parte del cuerpo tiene una forma y una estructura interna características que surgen durante el desarrollo embrionario: la médula espinal es un tubo hueco, el riñón se forma con túbulos microscópicos, cada pulmón está compuesto por espacios aéreos microscópicos, etc. Se necesitan muchas actividades celulares para el desarrollo de la morfología característica de un órgano, inclusive cambios programados en la forma celular. Los cambios en la forma de las células se producen sobre todo por cambios en la orientación de elementos del citoesqueleto dentro de las células. Uno de los mejores ejemplos de este fenómeno se ve en las etapas iniciales del desarrollo del sistema nervioso.

Hacia el final de la gastrulación en los vertebrados, las células externas (ectodérmicas) situadas a lo largo de la superficie dorsal del embrión se alargan y forman una capa epitelial alta llamada placa neural (fig. 9.77a,b). Las células de la placa neural se alargan cuando los microtúbulos se orientan con sus ejes longitudinales en paralelo al eje de la célula (recuadro, fig. 9.77b). Después de la elongación, las células del epitelio neural se constriñen en uno de sus extremos, lo que les da una forma de cuña y toda la capa de células se curva hacia adentro (fig. 9.77c). Este último cambio en la forma celular se debe a la contracción de una banda de microfilamentos que se ensamblan en la región cortical de la célula, justo debajo de la membrana celular apical (recuadro, fig. 9.77c). Por último, la curvatura del tubo neural ocasiona que los bordes externos se toquen uno al otro, con lo que se forma un tubo cilíndrico y hueco (fig. 9.77d,e) que da origen a todo el sistema nervioso del animal.

El citoesqueleto se compone de tres tipos distintos de estructuras fibrosas: microtúbulos, filamentos intermedios y microfilamentos (filamentos de actina), que participan en varias actividades celulares. Los elementos del citoesqueleto funcionan en conjunto como un soporte estructural que ayuda a mantener la forma de la célula; como una red interna encargada de colocar los diversos organelos en el interior de la célula; como parte de la maquinaria necesaria para el movimiento de materiales y organelos dentro de las células y como elementos generadores de fuerza encargados del movimiento celular de un sitio a otro (pág. 324).

Los microtúbulos son estructuras tubulares huecas de 25 nm de diámetro que se ensamblan de la proteína tubulina y, además del citoesqueleto, forman parte del huso mitótico, los centríolos y el centro de los cilios y los flagelos. Los microtúbulos son polímeros ensamblados con heterodímeros alfa-beta de tubulina que se disponen en hileras, o protofilamentos. Muchas de las propiedades de los microtúbulos, incluida su estabilidad y capacidades de interacción, están influenciadas por miembros de un grupo de proteínas relacionadas con microtúbulos (MAPs). Por su rigidez, los microtúbulos a menudo actúan como soporte, en forma parecida a las vigas de acero que sostienen un edificio alto. El papel estructural de los microtúbulos es más evidente al examinar los procesos muy alargados, como los axones, que están llenos de microtúbulos orientados en paralelo al eje longitudinal de la prolongación. Los microtúbulos también participan en actividades tan diversas como el depósito de celulosa en la pared de una célula vegetal; el mantenimiento de la posición de los organelos membranosos de la vía biosintética, inclusive el aparato de Golgi y el retículo endoplásmico y en el movimiento de vesículas y otros materiales entre el cuerpo celular y las terminaciones axónicas de la célula nerviosa (pág. 330).

Tres familias de proteínas motoras están identificadas y caracterizadas: cinesinas y dineínas, que se mueven a lo largo de los microtúbulos y miosinas, que se mueven a lo largo de los microfilamentos. Las proteínas motoras son capaces de convertir la energía química almacenada en el ATP en energía mecánica que se emplea para mover cargamentos celulares unidos al motor. Las fuerzas se generan cuando los cambios en la conformación de la proteína motora se vinculan con un ciclo químico que implica la unión y la hidrólisis de nucleótidos y la liberación de los productos unidos (pág. 334).

En la mayor parte de los casos, las cinesinas y la dineína citoplásmica mueven materiales a lo largo de microtúbulos en sentidos opuestos. Tanto la cinesina como las dineínas citoplásmicas son proteínas motoras con cabezas globulares que interactúan con los microtúbulos y funcionan como máquinas generadoras de fuerza y un sitio contrario a la cabeza que se une con los tipos específicos de cargamento que se transporta. La cinesina mueve materiales hacia el extremo más de un microtúbulo, la dineína citoplásmica lo hace hacia el extremo menos. La cinesina participa en el movimiento de las vesículas derivadas del retículo endoplásmico, los endosomas, los lisosomas y los gránulos secretores y se demostró que es la principal proteína motora que media el transporte anterógrado en un axón (del cuerpo celular al final del axón) (pág. 334).

La nucleación in vivo de los microtúbulos se produce en diversos centros de organización de microtúbulos (MTOC). En las células animales, los microtúbulos del citoesqueleto casi siempre se forman en el centrosoma, una estructura compleja que contiene dos centríolos con forma de barril rodeados por material pericentriolar electrodenso y amorfo. Los centríolos contienen nueve fibrillas espaciadas de manera uniforme, cada una de las cuales se forma con tres microtúbulos y por lo general en pares, cuyos integrantes están orientados en ángulo recto uno con respecto al otro. Los microtúbulos suelen irradiar desde el material pericentriolar, que contiene los componentes necesarios para la nucleación de los microtúbulos. Los microtúbulos que forman las fibras de un cilio o flagelo se originan del cuerpo basal, que en esencia tiene la misma estructura que el centríolo. Los centrosomas, cuerpos basales y otros MTOC comparten una proteína común llamada tubulina-γ, que tiene un papel clave en la nucleación de los microtúbulos (pág. 339).

Los microtúbulos del citoesqueleto son polímeros dinámicos que se someten a acortamiento, elongación, desensamble y nuevo ensamble. El desensamble del citoesqueleto microtubular puede inducirse con varios agentes, como colchicina, frío y concentraciones elevadas de Ca²⁺. Por lo general, los microtúbulos del citoesqueleto se desensamblan antes de la división celular y las subunidades de tubulina se reensamblan como parte del huso mitótico. Este proceso de desensamble y reensamble se revierte después de la división. En cualquier momento específico, algunos microtúbulos del citoesqueleto aumentan de longitud mientras que otros se encogen. Cuando los microtúbulos individuales se siguen en el tiempo, se observa que van y vienen por fases de crecimiento y acortamiento, un fenómeno que se conoce como inestabilidad dinámica. Tanto el crecimiento como el encogimiento ocurren sobre todo, si no es que de manera exclusiva, en el extremo más del polímero, el extremo opuesto al MTOC. Los dímeros de tubulina que se polimerizan en un microtúbulo contienen una molécula de GTP que se hidroliza poco después de su incorporación al polímero. Durante los periodos de polimerización rápida, la hidrólisis del GTP unido a los dímeros de tubulina incorporados se retrasa hasta después de la incorporación de nuevos dímeros, de modo que el extremo del microtúbulo contiene una tapa de dímeros tubulina-GTP que favorece la adición de más subunidades y el crecimiento del microtúbulo. La concentración de Ca²⁺ y proteínas de unión al extremo más (+TIP), así como la presencia de MAP específicas también pueden regular el ensamble y el desensamble (pág. 341).

Los cilios y flagelos contienen una estructura central, el axonema, que se compone de un conjunto de microtúbulos que sostienen el organelo que sobresale de la superficie celular y provee la maquinaria para generar las fuerzas para la locomoción. El corte transversal permite ver que un axonema consiste en nueve parejas externas de microtúbulos (un microtúbulo A completo y un microtúbulo B incompleto) que rodean a un par de microtúbulos individuales. Un par de brazos se proyecta del microtúbulo A de cada pareja. Los brazos están formados por dineína ciliar, una proteína motora encargada de usar la energía que libera la hidrólisis del ATP para generar la fuerza necesaria para el batir de los cilios y los flagelos. Esto se logra cuando los brazos de dineína de una pareja se unen con el microtúbulo B de la pareja vecina y luego presentan un cambio de conformación que ocasiona el deslizamiento del microtúbulo A, hasta una distancia perceptible. El deslizamiento en un lado del axonema se alterna con el deslizamiento del otro lado, de manera que parte de cilio o flagelo se dobla primero en una dirección y luego en la contraria. El deslizamiento de los microtúbulos ya se demostró en forma directa mediante la unión de esferas a las parejas de axonemas sin membrana para seguir sus movimientos relativos durante la reactivación (pág. 345).

Los filamentos intermedios (IF) son estructuras citoesqueléticas parecidas a cuerdas de unos 10 nm de diámetro que, según el tipo celular, pueden formarse por varias subunidades proteínicas distintas capaces de ensamblarse en tipos similares de filamentos. A diferencia de los microtúbulos, los filamentos intermedios están formados por bloques de construcción asimétricos (subunidades tetraméricas) que se ordenan en filamentos que carecen de polaridad. Los IF resisten las fuerzas de tensión y son hasta cierto punto insolubles; aún así, como los otros dos tipos de elementos citoesqueléticos, son estructuras dinámicas que incorporan con rapidez las subunidades con marcas fluorescentes que se inyectan en la célula. Se cree que el ensamble y el desensamble están controlados sobre todo por la fosforilación y la desfosforilación. Parece que los IF proporcionan estabilidad mecánica a las células y son necesarios para algunas funciones especializadas de tejidos particulares (pág. 354).

Los filamentos de actina (o microfilamentos) tienen 8 nm de diámetro, están formados por un polímero helicoidal doble de la proteína actina y tienen una función primordial en todos los tipos de contractilidad y motilidad celular. Según el tipo de célula y su actividad, los filamentos de actina pueden organizarse en conjuntos muy ordenados, en redes laxas y poco definidas o en paquetes muy ajustados. A menudo los filamentos de actina se identifican por su capacidad para unirse con el fragmento S1 de miosina, que también revela la polaridad del filamento. Aunque ambos extremos de un filamento de actina pueden ganar o perder subunidades, el extremo barbado (o más) del filamento es el sitio preferido para la adición de subunidades y el extremo afilado (o menos) es el sitio preferencial para la pérdida de las mismas. Para incorporarse en el extremo creciente de un filamento, una subunidad de actina debe estar unida con un ATP, que se hidroliza poco después de su incorporación. Las células mantienen un equilibrio dinámico entre las formas monoméricas y poliméricas de la actina, el cual puede alterarse por cambios en diversas condiciones locales. La participación de los filamentos de actina en un proceso particular es más fácil de probar si las células se tratan con citocalasina, que fomenta la despolimerización del filamento, o con faloidina, que impide el desensamble y la participación en actividades dinámicas (pág 356).

Las fuerzas que se encargan de los procesos dependientes de microfilamentos pueden generarse mediante el ensamble del filamento de actina o, más a menudo, como resultado de la interacción con la proteína motora miosina. La propulsión de ciertas bacterias a través del citoplasma de un fagocito infectado es un proceso impulsado por la polimerización de la actina. Las miosinas casi siempre se dividen en dos clases: las miosinas convencionales (tipo II) y las no convencionales (tipos I y III a XVIII). La miosina II es el motor molecular que genera la fuerza en varios tipos de tejidos musculares y también diversas actividades no musculares, inclusive la citocinesis. Las moléculas de miosina II contienen una larga cola cilíndrica unida a una de las dos cabezas globulares. Las cabezas se unen al filamento de actina, hidrolizan el ATP y experimentan los cambios de conformación necesarios para generar la fuerza. Se cree que el cuello actúa como brazo de palanca que amplifica los cambios en la conformación de la cabeza. La cola fibrosa media el ensamble de la miosina en los filamentos bipolares. La mayor parte de las miosinas no convencionales tienen una sola cabeza y dominios de cola variables; se cree que participan en la movilidad celular y el transporte de organelos (pág. 360).

La contracción de una fibra de músculo estriado se debe al deslizamiento de filamentos delgados de actina hacia el centro de las sarcómeras individuales de una miofibrilla y está impulsada por las fuerzas generadas en los puentes cruzados de la miosina que se extienden a partir de los filamentos gruesos. Los cambios que ocurren durante el acortamiento de una fibra muscular se reflejan en los cambios en el patrón de bandas de las sarcómeras, ya que las líneas Z de las orillas de la sarcómera se mueven hacia los bordes externos de las bandas A. La contracción se inicia cuando un impulso penetra al interior de la fibra muscular junto con los túbulos transversos membranosos, lo que estimula la liberación de Ca²⁺ de los sitios de almacenamiento en el retículo sarcoplásmico (SR). La unión de iones de calcio con las moléculas de troponina de los filamentos delgados produce un cambio en la conformación que mueve las moléculas de tropomiosina a una posición que expone los sitios para unión con miosina que las subunidades de actina del filamento delgado tienen. La interacción posterior entre la miosina y la actina inicia el deslizamiento del filamento (pág. 364).

La motilidad y la contractilidad no musculares dependen de algunas de las proteínas que se encuentran en las células musculares, pero que se disponen en configuraciones menos ordenadas, más lábiles y transitorias. La motilidad no muscular depende de la actina, casi siempre en conjunto con miosina. La organización y comportamiento de los filamentos de actina depende de diversas proteínas de unión con actina que influyen en el ensamble de los filamentos de actina, sus propiedades físicas y sus interacciones entre sí y con otros organelos celulares. En la lista se incluyen proteínas que estimulan la nucleación de actina para la formación rápida de los filamentos de actina; que secuestran monómeros de actina e impiden su polimerización; proteínas que forman una tapa sobre un extremo de un filamento de actina, lo cual puede bloquear el crecimiento del filamento o causar el desensamble del mismo; proteínas que forman enlaces cruzados entre los filamentos de actina para formar haces, mallas laxas o geles tridimensionales; proteínas que cortan los filamentos de actina y proteínas que vinculan a los filamentos de actina con la superficie interna de la membrana plasmática (pág. 371).

Los ejemplos de movilidad y contractilidad no muscular comprenden el arrastramiento de las células sobre un sustrato y el crecimiento axónico. Por lo general, el arrastramiento celular se efectúa mediante una proyección aplanada, similar a un velo, llamada lamelipodio, que se forma en el borde de avance de la célula. Cuando el lamelipodio sobresale de la célula, se adhiere al sustrato subyacente en puntos específicos y esto brinda sitios de anclaje temporal para que la célula se arrastre. La protrusión del lamelipodio se acompaña de nucleación y polimerización de los filamentos de actina y su asociación con varios tipos de proteínas de unión con la actina. Las fuerzas necesarias para la protrusión del lamelipodio provienen de la polimerización de la actina. La punta del axón en crecimiento consiste en un cono de crecimiento, que se parece a un fibroblasto móvil reptante; contiene varios tipos de procesos locomotores, como un lamelipodio, microespículas y filopodios. El cono de crecimiento explora el ambiente y alarga el axón por el trayecto apropiado (pág. 374).

1. Si se tirara de una miofibrilla de manera que la longitud de las sarcómeras aumentara casi 50%, ¿qué efecto se esperaría que esto tuviera en la capacidad contráctil de la miofibrilla? ¿Por qué? ¿Qué efectos ejercería sobre las bandas H, A e I?

2. Mencione tres sustancias diferentes con marca radiactiva o fluorescente que pueden inyectarse en una célula y que marcarían los microtúbulos celulares sin marcar los otros elementos del citoesqueleto.

3. ¿Cuáles son los dos tipos de motilidad no muscular que que no serían afectados por los anticuerpos contra la miosina I y la miosina II? ¿Por qué?

4. Un centríolo contiene______ microtúbulos completos y un cilio contiene_______ microtúbulos completos.

5. Los microtúbulos pueden formarse in vitro a partir de tubulina unida con análogos de GTP que (a diferencia del GTP) no pueden hidrolizarse. ¿Qué propiedades se esperaría que tuvieran estos microtúbulos?

6. Enumere dos cosas que cambiarían el equilibrio dinámico de una preparación in vitro de tubulina y microtúbulos hacia la formación de microtúbulos. Mencionar dos tratamientos que modificarían el equilibrio en la dirección contraria.

7. Se mencionó que el axonema ciliar o flagelar sin membrana es capaz de moverse con frecuencia y patrón normales. ¿Puede concluirse que la membrana plasmática no es importante para la función ciliar o flagelar?

8. Como las vesículas citoplásmicas se mueven en ambos sentidos dentro de un axón, ¿puede concluirse que algunos microtúbulos están orientados con sus extremos más hacia la terminación del axón y otros se orientan con la polaridad contraria? ¿Por qué sí o por qué no?

9. ¿Habría acuerdo en cuanto a la declaración de que el centrosoma desempeña una función crucial para establecer el ritmo de alargamiento y acortamiento de los microtúbulos de una célula animal? ¿Por qué sí o por qué no?

10. Si se comparara la estructura molecular de la cinesina y la miosina, que se cree evolucionaron de una proteína ancestral común, ¿qué partes (cabezas o colas) se esperaría que tuvieran más similitud entre ellas? ¿Por qué?

11. La figura 9.31a muestra la apariencia del corte transversal de un axonema ciliar cortado en la parte inferior del cilio. ¿Qué diferencias tendría la imagen de un corte transversal si se hubiera hecho muy cerca de la punta de un cilio al principio del movimiento de recuperación?

12. Si una molécula individual de cinesina puede moverse a una velocidad de 800 nm/s en una prueba de movilidad in vitro, ¿cuál es el ritmo máximo de recambio (moléculas de ATP hidrolizadas por segundo) mediante uno de los dominios motores de la molécula?

13. ¿Por qué supone que puede aprenderse más respecto a la dinámica de los microtúbulos con la inyección de tubulina fluorescente en una célula que con tubulina con marca radiactiva? ¿Se podría pensar en una pregunta que se respondiera mejor con la tubulina con marca radiactiva?

14. Supóngase que se descubrió que un ratón que carece de copias del gen para cinesina convencional no parece mostrar efectos adversos y vive hasta la vejez. ¿Qué se concluiría acerca de la función de la cinesina en la locomoción intracelular?

15. ¿Qué tipo de tejido de vertebrados se esperaría que fuera una excelente fuente de tubulina?, ¿y de actina?, ¿y de queratina? ¿Qué proteína cabría esperar que fuera la menos soluble y la más difícil de extraer? ¿Qué tipos de proteína se esperaría encontrar como contaminantes en una preparación de tubulina?, ¿cuáles en una preparación de actina?

16. La actina es una de las proteínas mejor conservadas durante la evolución. ¿Qué significa esto respecto a la estructura y la función de esta proteína en las células eucariotas?

17. De acuerdo con los datos de secuencias genómicas, la dineína citoplásmica está ausente en algunas plantas (p. ej., Arabidopsis) y sí se encuentra en otras (p. ej., arroz). ¿Sorprende este hallazgo? ¿Qué más podría hacerse para confirmar o rechazar esta declaración? ¿Cómo es posible que las células de plantas superiores operen sin dineína citoplásmica?

18. La acción de la miosina II (fig. 9.61) difiere de la de la cinesina (fig. 9.15), en que una de las cabezas de cinesina siempre está en contacto con un microtúbulo, mientras que ambas cabezas de la miosina se desprenden por completo del filamento de actina. ¿De qué forma se relacionan estas diferencias con los dos tipos de actividades motoras en las que participan estas proteínas?

19. Se cree que los núcleos de los microtúbulos de un axón se forman en el centrosoma, luego se cortan de su sitio de nucleación y se mueven hacia el axón. En el texto se mencionó que la dineína citoplásmica es la encargada del movimiento retrógrado de organelos en los axones, aunque también se piensa que este mismo motor media el movimiento anterógrado de los microtúbulos en estos mismos procesos celulares. ¿Cómo es posible que el mismo motor dirigido hacia el extremo menos participe en los movimientos en ambos sentidos?

20. Las proteínas motoras a menudo se describen como mecanoenzimas. ¿Por qué? ¿Podría aplicarse este mismo término virtualmente a todas las enzimas? ¿Por qué sí o por qué no?