Capítulo 11: Expresión génica: de la transcripción a la traducción

De muchas formas, el progreso de la biología en el siglo pasado se refleja en el concepto cambiante del gen. Como resultado del trabajo de Mendel, los biólogos aprendieron que los genes son elementos aislados que controlan la aparición de rasgos específicos. De haber tenido oportunidad, Mendel habría argumentado a favor del concepto de que un gen determina una característica. Boveri, Weismann, Sutton y sus contemporáneos descubrieron que los genes y su representación física formaban parte de los cromosomas. Morgan, Sturtevant y col., demostraron que los genes tienen una localización específica (se hallan en lugares determinados de cromosomas particulares y esta ubicación permanece constante de un individuo a otro). Griffith, Avery, Hershey y Chase probaron que los genes están compuestos de ácido desoxirribonucleico (DNA, deoxyribonucleic acid), mientras que Watson y Crick resolvieron el acertijo de la estructura de dicha molécula, lo que explicaba la manera en que este componente podía codificar información heredable.

A pesar de que las formulaciones de estos conceptos fueron trascendentales para la comprensión de la genética, ninguno de ellos definió el mecanismo por medio del cual la información almacenada en un gen controla las actividades celulares. Este es el tema principal que se revisa en el presente capítulo. Primero se describen las propiedades de los genes y luego su función en la expresión de los caracteres hereditarios.

En 1908 el médico escocés Archibald Garrod señaló que los síntomas observados en personas afectadas por ciertas enfermedades hereditarias raras eran efecto de la ausencia de enzimas específicas; este fue el primer hallazgo importante de la función de los genes. Uno de los trastornos que investigó Garrod fue la alcaptonuria, un padecimiento fácil de diagnosticar por el color oscuro que adquiere la orina cuando se expone al aire. Observó, en pacientes con alcaptonuria, la ausencia en la sangre de una enzima que oxida el ácido homogentísico, un compuesto formado durante el procesamiento de los aminoácidos fenilalanina y tirosina. Conforme dicho ácido se acumula, se excreta en la orina y le confiere una tonalidad oscura al ser oxidado por el aire. Garrod había descubierto la relación entre un gen, una enzima y una enfermedad metabólica específicos. Denominó a estas enfermedades “metabolopatías congénitas”. Tal y como ocurrió con otras observaciones tempranas cruciales para la genética, los descubrimientos de Garrod se ignoraron durante décadas.

En 1940 George Beadle y Edward Tatum, del California Institute of Technology, resucitaron la idea de que los genes controlaban la producción de enzimas. Estos investigadores estudiaron al hongo Neurospora, un moho tropical del pan que en condiciones normales puede crecer en medios muy simples con una sola fuente de carbono orgánico (p. ej., un azúcar), sales inorgánicas y biotina (una vitamina del complejo B). Puesto que sus necesidades para vivir son mínimas, debía tener capacidad para sintetizar todos los metabolitos requeridos. Beadle y Tatum razonaron que un organismo con una capacidad de síntesis tan amplia debía ser muy sensible a deficiencias enzimáticas, fáciles de descubrir mediante el protocolo experimental apropiado. En la figura 11.1 se muestra el método simplificado que se utilizó.

En esencia, el plan de dichos investigadores consistía en radiar las esporas del moho y analizarlas en busca de mutaciones que causaran que las células carecieran de alguna enzima. Para detectar tales mutaciones, investigaron la capacidad de las esporas radiadas para crecer en un medio mínimo, sin los componentes esenciales que debía sintetizar el propio organismo (fig. 11.1). Si una espora era incapaz de crecer en medio mínimo, pero se desarrollaba en un medio de cultivo complementado con alguna coenzima particular (p. ej., el ácido pantoténico de la coenzima A), entonces los investigadores podían concluir que las células portaban una deficiencia enzimática que impedía que sintetizaran dichos compuestos esenciales.

Beadle y Tatum radiaron primero a más de 1 000 células. Dos de las esporas perdieron su capacidad de crecer en un medio mínimo: una necesitó piridoxina (vitamina B₆) y la otra tiamina (vitamina B₁). Por último, se investigó la descendencia de casi 100 000 esporas radiadas y se aislaron docenas de mutantes. Cada organismo mutado tenía un defecto genético y por lo tanto, presentaba una deficiencia enzimática que impedía a la célula catalizar una reacción metabólica particular. Los resultados fueron claros: un gen específico portaba información para elaborar una enzima particular. Esta conclusión se conoció como la hipótesis de “un gen-una enzima”. Más tarde, cuando se descubrió que las enzimas se componen por lo general de más de una cadena de polipéptidos, cada una codificada por un gen distinto, el concepto se denominó “un gen-un polipéptido”. Si bien esta relación se aproximó mucho más a la función básica de un gen, tuvo que modificarse debido al descubrimiento de que un solo gen genera con frecuencia una variedad de polipéptidos, en primera instancia como resultado de eventos de corte y empalme alternativos (sección 12.5). Pronto se advirtió que describir a un gen sólo como un depósito de información sobre polipéptidos era una definición demasiado limitada y parca. Muchos genes codifican moléculas de ácido ribonucleico (RNA, ribonucleic acid) que, en vez de contener información para la síntesis de polipéptidos, actúan por cuenta propia. Teniendo en consideración tal hecho, podría ser mejor definir a un gen como un segmento de DNA que contiene la información para un solo polipéptido o para uno o más RNA funcionales.

Sinopsis del tránsito de la información dentro de las células

La información que está en un segmento de DNA se torna asequible para la célula gracias a la formación de una molécula de RNA. La síntesis de un ácido ribonucleico a partir de una plantilla de DNA recibe el nombre de transcripción. Este término denota un proceso en el cual se reescribe, o se transcribe, la información codificada en los cuatro desoxirribonucleótidos del DNA (representados por letras), en un lenguaje similar compuesto por los cuatro ribonucleótidos del RNA (también simbolizados con letras). Más adelante se analizará el mecanismo de la transcripción, pero primero se expone la participación de los genes en la formación de polipéptidos.

Estudios realizados en el decenio de 1950 permitieron identificar la relación que existe entre la información genética y las secuencias de aminoácidos, pero dicho conocimiento por sí mismo no aportó pistas en cuanto al mecanismo mediante el cual se genera un polipéptido específico. Ahora se sabe que existe un intermediario entre un gen y su polipéptido, es el llamado RNA mensajero (mRNA, messenger RNA). El descubrimiento de dichos mediadores lo realizaron en 1961 François Jacob y Jacques Monod, del Pasteur Institute en París, Sydney Brenner, de la University of Cambridge, y Matthew Meselson, del California Institute of Technology. Un mRNA se ensambla como una copia de una de las dos cadenas de DNA que constituyen un gen. Esta secuencia de nucleótidos es complementaria de la del gen a partir del cual se transcribió, por lo que éste y el mRNA tienen la misma información. Por esta razón, es posible describir a un RNA como una cadena “de sentido” o un RNA codificador. Los mRNA de organismos eucariotas no se sintetizan en su forma final (o madura), sino que deben ser moldeados (o procesados) a partir de mRNA precursores (o pre-mRNA) de mayor tamaño. En la figura 11.2 se muestra una revisión general de la participación del mRNA en el tránsito de la información en una célula eucariota.

El uso de RNA mensajeros permite a la célula separar la información almacenada de la información que se utiliza. Mientras un gen permanece aislado dentro del núcleo como parte de una enorme molécula inmóvil de DNA, su información puede transmitirse a un ácido nucleico móvil mucho más pequeño, un mRNA, capaz de llegar al citoplasma. Una vez fuera del núcleo, este mensajero puede servir como plantilla para controlar la incorporación de aminoácidos en el orden específico codificado por la secuencia de nucleótidos del DNA. El uso del mRNA también permite a la célula incrementar de manera considerable su actividad. Una molécula de DNA puede servir como plantilla para la formación de muchas moléculas de mRNA, cada una de las cuales puede usarse para la síntesis de un gran número de polipéptidos.

Las proteínas se sintetizan en el citoplasma mediante un proceso complejo conocido como traducción. Ésta requiere la participación de docenas de componentes diferentes, incluidos los ribosomas. Estos son complejas “máquinas” citoplásmicas que pueden programarse, al igual que una computadora, para traducir la información codificada por cualquier mRNA. Los ribosomas contienen proteínas y RNA. Los RNA de un ribosoma se conocen como RNA ribosómicos (rRNA, ribosomal RNAs) y, del mismo modo que los mRNA, cada uno se transcribe a partir de las cadenas de DNA de un gen. En lugar de funcionar como portadores de información, los rRNA brindan soporte estructural y catalizan la reacción química en la que los aminoácidos se unen entre sí mediante enlaces covalentes. Los RNA de transferencia (tRNA, transfer RNAs) constituyen un tercer grupo importante de ácidos ribonucleicos que se requiere para la síntesis de proteínas. Los RNA de transferencia son necesarios para traducir la información codificada en los nucleótidos del mRNA en el “alfabeto” de aminoácidos de un polipéptido.

Los rRNA y los tRNA deben su actividad a sus complejas estructuras secundarias y terciarias. A diferencia del DNA, que siempre tiene una conformación bicatenaria helicoidal (sin importar de donde provenga), muchos RNA se pliegan para adoptar formas tridimensionales complejas, muy diferentes entre los diversos tipos de RNA. En consecuencia, al igual que las proteínas, los RNA pueden efectuar diversas funciones porque adoptan una gran variedad de formas. Como en las proteínas, el doblamiento de las moléculas de RNA sigue ciertas reglas. Mientras que el plegamiento de proteínas es regulado por la orientación de residuos hidrófobos en el interior de las moléculas, el plegamiento del RNA ocurre gracias a la integración de regiones que tienen pares de bases complementarios (fig. 11.3). Como se observa en la figura 11.3, en las regiones donde se aparean las bases se forman por lo general “tallos” de cadenas dobles (helicoidales), los cuales están conectados a “asas” monocatenarias. A diferencia del DNA, el cual consiste exclusivamente en cadenas que forman los apareamientos estándar de Watson-Crick (G-C, A-T), los RNA contienen a menudo pares de bases que no son comunes (recuadro de la fig. 11.3) y bases nitrogenadas modificadas. Estas regiones no convencionales sirven como sitios de reconocimiento para proteínas y otros RNA, promueven el plegamiento de la molécula y ayudan a estabilizar su estructura. La importancia de la complementariedad entre pares de bases se extiende más allá de la estructura del tRNA y del rRNA. Como se advierte a lo largo de este capítulo, el apareamiento de bases entre moléculas de RNA tiene una función central en la mayor parte de las actividades en las que éstas intervienen.

Las funciones de los mRNA, rRNA y tRNA se exploran con detalle en las siguientes secciones de este capítulo. Las células eucariotas contienen otros ácidos ribonucleicos que también poseen funciones vitales en el metabolismo celular; a saber, RNA nucleares pequeños (snRNA, small nuclear RNAs), RNA nucleolares pequeños (snoRNA, small nucleolar RNAs), RNA interferentes pequeños (siRNA, small interfering RNAs), RNA asociados a piwi (piRNA, piwi-interactive RNAs), microRNA (miRNA) y otros RNA no codificadores, es decir, que no contienen información para definir secuencias de aminoácidos. Muchas de estas moléculas desempeñan funciones reguladoras y controlan diversos aspectos de la expresión génica. En los últimos años se han identificado muchos de estos RNA, lo cual pone en evidencia una vez más que existen innumerables actividades celulares que aún están por ser descubiertas.

La estructura general del RNA puede revisarse en la página 77.

La transcripción es un proceso en el cual una cadena de DNA provee la información para la síntesis de una cadena de RNA. Las enzimas encargadas de la transcripción en células tanto procariotas como eucariotas se denominan RNA polimerasas dependientes de DNA, o sólo RNA polimerasas. Estas enzimas incorporan nucleótidos, uno a la vez, en una cadena de RNA cuya secuencia es complementaria de una de las cadenas de DNA, la cual actúa como plantilla (o molde).

El primer paso en la síntesis de un RNA es la vinculación de la polimerasa con el DNA que sirve como plantilla. Esto plantea un tema de interés general: las interacciones específicas que ocurren entre dos macromoléculas muy disímiles, proteínas y ácidos nucleicos. Así como diferentes proteínas han evolucionado para unirse a tipos distintos de sustratos y catalizar reacciones diversas, otras evolucionaron para reconocer secuencias específicas de nucleótidos en una cadena de ácido nucleico y unirse a ellas. El sitio de la molécula de DNA donde se adhiere la RNA polimerasa antes de iniciar la transcripción se llama promotor. Las RNA polimerasas celulares no son capaces de reconocer a los promotores por sí mismas y requieren la ayuda de proteínas adicionales conocidas como factores de transcripción. Además de suministrar un sitio de enlace para la polimerasa, el promotor contiene la información que determina cuál de las dos cadenas de DNA se transcribe y el sitio donde se inicia la transcripción.

La RNA polimerasa se mueve a lo largo de la cadena de DNA que sirve como plantilla hacia el extremo 5′ (p. ej., en dirección 3′ → 5′). Conforme la enzima avanza, el DNA se desenrolla de manera temporal y la polimerasa ensambla una cadena complementaria de RNA que crece en dirección 5′ → 3′ (fig. 11.4a,b). Como se indica en la figura 11.4c, la RNA polimerasa cataliza la favorable reacción

RNA_n + NTP → RNA_n+1 + PP_i

en la que los sustratos (ribonucleósidos trifosfatados [NTP, ribonucleoside triphosphate]) se dividen en nucleósidos monofosfatados conforme se polimerizan en una cadena covalente. Las reacciones mediante las cuales se sintetizan los ácidos nucleicos (y las proteínas) se diferencian de forma inherente de aquellas del metabolismo intermediario discutidas en el capítulo 3. En tanto que algunas de las reacciones que conducen a la formación de moléculas pequeñas, como los aminoácidos, pueden acercarse lo suficiente al equilibrio, con la posibilidad de medir una reacción inversa importante, las reacciones que llevan a la síntesis de ácidos nucleicos y proteínas deben ocurrir en condiciones en las que no exista una reacción inversa. Este fenómeno se ejemplifica durante la transcripción con la ayuda de una segunda reacción favorable:

PP_i → 2 P_i

catalizada por una enzima diferente, una pirofosfatasa. En este caso, el pirofosfato (PP_i) producido en la primera reacción se hidroliza en un fosfato inorgánico (P_i). La hidrólisis del pirofosfato genera una gran cantidad de energía libre y hace irreversible la incorporación del nucleótido.

A medida que la polimerasa se mueve a lo largo de la plantilla de DNA, incorpora nucleótidos complementarios en la molécula de RNA en crecimiento. Un nucleótido se agrega a la cadena de RNA si es capaz de formar un par de bases apropiado (de Watson-Crick) con el nucleótido de la cadena de DNA que se transcribe. Esto puede revisarse en la figura 11.4c, en la que el 5′-trifosfato de adenosina entrante se aparea con el nucleótido portador de timina del DNA que sirve como plantilla. Una vez que la polimerasa ha pasado un segmento particular del DNA, la doble hélice se vuelve a formar (como se observa en la figura 11.4a,b). En consecuencia, la cadena de RNA no permanece vinculada con su plantilla como un híbrido DNA-RNA (excepto por unos nueve nucleótidos localizados justo detrás del sitio donde actúa la polimerasa). Las RNA polimerasas son capaces de incorporar alrededor de 20 a 50 nucleótidos por segundo en una molécula de RNA y muchos genes en las células son transcritos de forma simultánea por 100 o más polimerasas (como se observa en la figura 11.11c). La frecuencia con la cual se transcribe un gen está regulada de manera estricta y puede variar en gran medida dependiendo del gen en cuestión y de la situación prevalente. La micrografía electrónica de la figura 11.4d muestra una molécula de DNA de un fago, la cual tiene adheridas numerosas moléculas de RNA polimerasa.

Las RNA polimerasas son capaces de formar RNA muy largos. Por consiguiente, la enzima tendrá que permanecer unida al DNA a lo largo de grandes segmentos (se dice que la enzima es procesiva). Al mismo tiempo, la enzima debe tener una vinculación lo suficientemente laxa para poder moverse de un nucleótido al siguiente de la plantilla. Es difícil estudiar ciertas propiedades de las RNA polimerasas, como la procesividad, utilizando métodos bioquímicos que tienden a promediar las diferencias que existen entre proteínas individuales. Por lo tanto, los investigadores han desarrollado técnicas que hacen posible seguir las actividades de una sola molécula de RNA polimerasa, similares a las empleadas para estudiar motores del citoesqueleto individuales. Dos ejemplos de estos estudios se muestran en la figura 11.5. En ellos una molécula de RNA polimerasa está unida a la superficie de un cubreobjetos y se permite que transcriba una molécula de DNA que contiene unida de manera covalente a uno de sus extremos una pequeña cuenta fluorescente, la cual puede seguirse mediante microscopia de fluorescencia.

En la figura 11.5a, la cuenta está libre para moverse en el medio y su rango de movimiento es proporcional a la longitud del DNA entre la polimerasa y la cuenta. Conforme la polimerasa transcribe la plantilla, la cadena de DNA se alarga y el movimiento de la esfera se incrementa. Este tipo de sistema permite a los investigadores estudiar la velocidad de transcripción de una polimerasa individual y determinar si ésta transcribe el DNA en un movimiento estable o discontinuo. En la figura 11.5b, la cuenta localizada en el extremo de la molécula de DNA que se transcribe queda atrapada por un rayo láser (pág. 143). La poca fuerza desarrollada por el láser puede variarse lo suficiente para impedir que la polimerasa continúe transcribiendo al DNA. Las mediciones realizadas en moléculas individuales de RNA polimerasa ejecutando la transcripción indican que estas enzimas pueden moverse sobre la plantilla, una base (3.4 Å) por vez, con una fuerza muchas veces mayor que la de una molécula de miosina.

Aunque las polimerasas son motores relativamente poderosos, no se encuentran siempre en un estado de movimiento continuo, sino que pueden detenerse en ciertos puntos a lo largo de la plantilla de DNA e incluso retroceder antes de reasumir su avance. Se han identificado diversos factores de elongación que amplían la capacidad de la enzima para superar los obstáculos anteriores. En algunos casos, como ocurre después de la inserción de un nucleótido incorrecto, una polimerasa inmóvil debe retroceder y después digerir el extremo 3′ del transcrito recién sintetizado y regenerar la porción faltante antes de continuar su movimiento. A la capacidad de la RNA polimerasa para identificar y eliminar un nucleótido incorporado de manera errónea se le conoce como “edición”. Esta función correctora la desempeña el mismo sitio activo, localizado dentro de la enzima, que se encarga de la incorporación de nucleótidos.

En este punto de la revisión es oportuno examinar las diferencias que existen entre los procesos de transcripción de las células procariotas y las eucariotas.

Transcripción en bacterias

Las bacterias, como E. coli, contienen RNA polimerasa de un solo tipo, compuestas de cinco subunidades en estrecha relación para formar un núcleo enzimático. Si éste se purifica y se agrega a una solución de moléculas de DNA bacteriano y ribonucleósidos trifosfatados, la enzima se une al DNA y sintetiza RNA. Sin embargo, las moléculas de RNA generadas por una polimerasa purificada no son las mismas que las halladas dentro de las células, porque el núcleo de la enzima se une de manera aleatoria a sitios del DNA (fig. 11.6a) que se ignorarían en condiciones normales in vivo. No obstante, si un polipéptido accesorio purificado llamado factor sigma (σ) se agrega a la RNA polimerasa antes de que ésta se una al DNA, la transcripción comienza en sitios específicos (fig. 11.6b-d). La unión de dicho factor al núcleo de la enzima incrementa la afinidad de ésta para unirse a los sitios promotores del DNA y disminuye su atracción por las secuencias no promotoras. Como resultado, se cree que la enzima completa se desliza con libertad por el DNA hasta que reconoce una región promotora adecuada y se une a ella.

Los análisis de cristalografía con rayos X de la RNA polimerasa bacteriana (fig. 11.8) revelan una molécula con forma de “tenazas de cangrejo” con un par de pinzas móviles que rodean un conducto interno con carga positiva. Cuando el factor σ interactúa con el promotor, las pinzas de la enzima fijan el dúplex de DNA en dirección 3′, el cual reside dentro del conducto (como se muestra en la figura 11.4b). La enzima separa entonces (o desnaturaliza) las dos cadenas de DNA en la región que rodea al sitio de inicio (fig. 11.6c). La separación de las hebras torna a la plantilla accesible al sitio activo de la enzima, el cual se halla en la pared posterior del conducto. El inicio de la transcripción parece ser un proceso difícil de activar debido a que una RNA polimerasa por lo general realiza numerosos intentos infructuosos para ensamblar un transcrito de RNA. Una vez que 10 nucleótidos se han incorporado de manera satisfactoria a un transcrito en crecimiento, la enzima sufre un cambio conformacional importante y se transforma en un complejo transcripcional de elongación que puede moverse de modo procesivo a lo largo del DNA. En el modelo que se muestra en la figura 11.6d, la formación de un complejo de elongación es seguida por la liberación del factor σ.

Como se indicó antes, los promotores son sitios en el DNA a los que se unen las RNA polimerasas. Los promotores bacterianos se localizan en la región de una cadena de DNA que precede al sitio de inicio de la síntesis del RNA (fig. 11.7). El nucleótido en el cual comienza la transcripción se marca como +1 y el nucleótido anterior al sitio, como −1. Las porciones del DNA anteriores al sitio de iniciación (hacia el extremo 3′ de la plantilla) se dice que se encuentran en dirección 5′ (o corriente arriba) del sitio de inicio. Las porciones del DNA que están después del sitio de inicio (hacia el extremo 5′ de la plantilla) se dice que están en dirección 3′ (o corriente abajo) del sitio de inicio. Las porciones del DNA que están después del sitio de inicio se encuentran en dirección 5′ (o corriente abajo). El análisis de las secuencias de DNA corriente arriba de un gran número de genes bacterianos revela que dos secuencias pequeñas de DNA son similares entre diferentes genes. Una de éstas se localiza aproximadamente 35 bases en dirección 5′ del sitio de inicio y casi siempre presenta la secuencia TTGACA (fig. 11.7). Dicha sucesión de bases (conocida como el elemento −35) se denomina secuencia de consenso, lo cual indica que es la versión más común de una secuencia conservada, aunque hay algunas variaciones entre los diferentes genes. La segunda secuencia conservada se localiza alrededor de 10 bases en dirección 5′ del sitio de inicio, donde aparece la sucesión de bases TATAAT (fig. 11.7). Este punto en el promotor, llamado caja de Pribnow por la persona que lo descubrió, se encarga de identificar el nucleótido preciso en el cual inicia la transcripción. Conforme el factor σ reconoce la caja de Pribnow, residuos aminoácidos dentro de la proteína interactúan con cada uno de los seis nucleótidos de la secuencia TATAAT de la cadena que no funciona como plantilla. Dos de estos nucleótidos son separados de la cadena y llevados al centro de la proteína. Es posible que dicha acción inicie la fusión del área adyacente al DNA promotor y la formación de la burbuja de transcripción que aparece en las figuras 11.6 y 11.7.

Las células bacterianas poseen diferentes factores σ que reconocen distintas versiones de la secuencia promotora. La proteína σ⁷⁰ se conoce como el “factor σ de mantenimiento” porque inicia la transcripción de la mayor parte de los genes. Factores σ alternativos comienzan la transcripción de un pequeño número de genes específicos que participan en una respuesta común. Por ejemplo, cuando las células de E. coli se someten a una repentina elevación de la temperatura, se sintetiza un nuevo factor σ que reconoce una secuencia promotora diferente, lo cual induce la transcripción coordinada de una variedad de genes de choque térmico. Los productos de estos genes protegen a las proteínas de la célula de daños por el aumento de temperatura (pág. 80).

Del mismo modo que la transcripción inicia en puntos específicos en un cromosoma, ésta también termina cuando se alcanza una secuencia nucleotídica específica. En casi la mitad de los casos se requiere una proteína semejante a un anillo llamada rho para la conclusión de la transcripción bacteriana. Dicha molécula rodea al RNA recién sintetizado y se mueve a lo largo de la cadena en dirección 5′ → 3′ hacia la polimerasa, donde ésta separa el RNA transcrito del DNA al cual está unido. En otros casos, la polimerasa detiene la transcripción cuando alcanza una secuencia de terminación. Por lo general estas secuencias se pliegan en forma de horquilla, lo cual hace que la RNA polimerasa libere la cadena de RNA completada sin necesitar factores adicionales.

Transcripción y procesamiento del RNA en células eucariotas

Como descubrió Robert Roeder en la University of Washington en 1969, las células eucariotas tienen tres enzimas de transcripción distintivas en sus núcleos. Cada una de ellas está encargada de sintetizar un grupo diferente de moléculas de RNA (cuadro 11.1). Las plantas tienen dos RNA polimerasas adicionales que no son esenciales para la vida. No se ha encontrado alguna célula procariota con múltiples RNA polimerasas, mientras que los organismos eucariotas más sencillos (las levaduras) tienen los mismos tres tipos nucleares que se encuentran en las células de los mamíferos. Esta diferencia en el número de RNA polimerasas es otra distinción clara entre las células procariotas y las eucariotas.

La figura 11.8a muestra las estructuras superficiales de las RNA polimerasas de cada uno de los tres dominios de la vida: arquebacterias, bacterias y eucariotas. Una examinación cuidadosa de esta ilustración revela varias características. Resulta evidente que las enzimas de las arquebacterias y de las eucariotas tienen más similitudes estructurales entre sí que las enzimas bacterianas y las eucariotas. Esta característica refleja la relación evolutiva que hay entre las arquebacterias y las bacterias, la cual se explicó en la página 29. Las subunidades que conforman cada una de las proteínas mostradas en la figura 11.8a están indicadas con un color distinto. Resulta evidente de inmediato que las RNA polimerasas son enzimas con múltiples componentes. Las subunidades que son homólogas entre sí entre las diferentes enzimas (o sea, que provienen de un polipéptido ancestral común) se muestran con el mismo color. Por lo tanto, en la figura 11.8a también se observa que las RNA polimerasas de los tres dominios comparten varias subunidades. Aunque la enzima de levadura mostrada en la figura 11.8a tiene un total de 12 subunidades, siete más que su contraparte bacteriana, la estructura central fundamental de ambas moléculas es idéntica. Esta conservación evolutiva en la estructura de la RNA polimerasa se revela en la figura 11.8b, que muestra las regiones homólogas de las enzimas bacterianas y eucariotas con una resolución mucho más alta.

El entendimiento de la transcripción en los organismos eucariotas avanzó en gran medida gracias a la publicación de Roger Kornberg y colaboradores, de la Stanford University en 2001, donde se expuso la estructura cristalográfica de la RNA polimerasa II de las levaduras. Como resultado de estos estudios, y de los de otros laboratorios en los años subsiguientes, se conoce mucho sobre el mecanismo de acción de las RNA polimerasas conforme se mueven por el DNA y transcriben una cadena complementaria de ácido ribonucleico. A diferencia de las procariotas, las eucariotas necesitan de una gran variedad de proteínas accesorias, o factores de transcripción, para producir RNA. Estas proteínas participan casi sin excepción en cada aspecto del proceso de la transcripción, desde la unión de la polimerasa a la plantilla del DNA y el inicio de la transcripción, hasta la elongación y la terminación. A pesar de que los factores de transcripción son cruciales para la operación de los tres tipos de RNA polimerasas eucariotas, sólo se considerará su participación en la síntesis de mRNA a través de la RNA polimerasa II (pág. 442).

Los tres tipos principales de RNA (mRNA, rRNA y tRNA) derivan de moléculas precursoras de RNA que son mucho más grandes que el producto final. Este precursor inicial tiene una longitud igual a la del DNA que se transcribe y se llama transcrito primario, o pre-RNA. El segmento de DNA del cual procede un transcrito primario se conoce como unidad de transcripción. Los transcritos primarios no existen dentro de las células como RNA desnudos, sino que se vinculan con proteínas incluso al sintetizarse. Por lo regular, estos pre-RNA tienen una existencia efímera y se procesan en RNA pequeños funcionales por medio de reacciones de “corte y empalme”. El procesamiento del RNA requiere de una gran variedad de pequeños RNA (de 90 a 300 nucleótidos de longitud) y sus proteínas relacionadas. En las siguientes secciones se examinan las actividades vinculadas con la transcripción y el procesamiento de cada uno de los tipos principales de RNA eucariota.

Una célula eucariota puede contener millones de ribosomas, cada uno formado por varias moléculas de rRNA unidas a docenas de proteínas ribosómicas. La composición de los ribosomas de los mamíferos se muestra en la figura 11.9. Estos son tan numerosos que más de 80% del RNA en la mayoría de las células es ribosómico. Para garantizar que las células sean capaces de tener esa gran cantidad de transcritos, las secuencias de DNA que codifican el rRNA se repiten cientos de veces. Este DNA, conocido como rDNA, se localiza casi siempre agrupado en una o varias regiones del genoma humano. Éste posee cinco acumulaciones de rDNA, cada una en distintos cromosomas. En una célula en interfase, los grupos de rDNA están reunidos y forman una o más estructuras nucleares de morfología irregular, conocidas como nucléolos, que participan en la generación de ribosomas (fig. 11.10a).

La mayor parte de un nucléolo se compone de subunidades ribosómicas nacientes que le confieren una apariencia granular (fig. 11.10b). Localizadas dentro de esta masa se encuentran una o más porciones nucleares redondeadas formadas en primera instancia de material fibrilar, el cual contiene al parecer moldes de rDNA y transcritos incipientes de rRNA, como se describe en la leyenda de la figura 11.10. En las siguientes secciones se describe el proceso por medio del cual se sintetizan estos transcritos de rRNA.

Síntesis de los precursores de rRNA

Por lo general, los ovocitos son células muy grandes (p. ej., de 100 μm de diámetro en mamíferos) y los de anfibios suelen ser gigantes (con un diámetro mayor a 2.5 mm). Durante el crecimiento de los ovocitos de anfibio, la cantidad de rDNA en la célula se incrementa de manera considerable y también el número de nucléolos (fig. 11.11a). Se requiere la amplificación selectiva de rDNA para generar un gran número de ribosomas, que se necesitan para que el huevo fecundado comience su desarrollo embrionario. Como estos ovocitos contienen cientos de nucléolos, cada uno de los cuales elabora rRNA de modo activo, son modelos ideales para el estudio de la síntesis de rRNA y su procesamiento.

La comprensión de la síntesis del rRNA (y de la transcripción del DNA en general) avanzó de forma notable a finales de la década de 1960 con el desarrollo de técnicas diseñadas por Oscar Miller Jr., de la University of Virginia, para visualizar “genes activos” por medio de microscopia electrónica. Para llevar a cabo estos ensayos, las porciones fibrilares de los nucléolos de ovocitos se prepararon de manera cuidadosa para revelar la presencia de grandes fibras circulares. Cuando una de estas estructuras se examinó por medio de microscopia electrónica, se observó algo semejante a un árbol de Navidad (fig. 11.11b,c). Las micrografías electrónicas de la figura 11.11 y los dibujos interpretativos de la figura 11.12 revelan diferentes aspectos de la actividad nucleolar y de la síntesis de rRNA.

1. La micrografía de la figura 11.11b muestra numerosos genes que codifican RNA ribosómico, situados uno después del otro a lo largo de una sola molécula de DNA, lo cual revela el ordenamiento en tándem de los genes de rRNA repetidos.

2. La micrografía de la figura 11.11b revela una imagen estática de sucesos dinámicos que ocurren en el nucléolo. La fotografía provee con gran detalle información acerca de los procesos de la transcripción del rRNA. Cada una de las 100 o más fibras que emergen del DNA, como las ramas de un árbol de Navidad, es un transcrito naciente de rRNA que aparece en proceso de elongación. Los gránulos oscuros en la base de cada fibrilla, que son visibles en la fotografía magnificada de la figura 11.11c, son las moléculas de RNA polimerasa I que están sintetizando su transcrito correspondiente. La longitud de las fibrillas se incrementa de forma gradual desde uno de los extremos del tronco del árbol hasta el lado opuesto. Las fibrillas cortas son moléculas de RNA con pocos nucleótidos, unidas muy cerca del sitio de inicio de la transcripción mediante moléculas de polimerasa. Entre más largos sean los transcritos, más cerca estarán de la terminación de la transcripción. El segmento de DNA rodeado de fibrillas de RNA corresponde a una sola unidad de transcripción (figura 11.12). El promotor se encuentra en dirección 5′ del sitio de inicio de la transcripción. La elevada densidad de las moléculas de RNA polimerasa a lo largo de cada unidad de transcripción (cerca de una por cada 100 pares de bases de DNA) refleja la gran tasa de síntesis de rRNA en los nucléolos de estos ovocitos.

3. En la figura 11.11c se observa que los transcritos nacientes contienen partículas asociadas, que consisten en RNA y proteínas que trabajan en conjunto para convertir los rRNA precursores en sus productos finales y ensamblarlos en subunidades ribosómicas. Tales fenómenos de procesamiento ocurren conforme se sintetizan las moléculas de RNA.

4. Como puede observarse en la figura 11.11b, las regiones de la fibra del DNA localizadas entre unidades de transcripción adyacentes carecen de cadenas nacientes de RNA. Debido a que estas áreas del grupo de genes ribosómicos no se transcriben, se conocen como espaciadores no transcritos (fig. 11.12). Éstos están presentes entre varios tipos de genes repetidos en tándem, incluidos los que codifican los tRNA y las histonas.

Procesamiento del rRNA precursor

Los ribosomas eucariotas poseen cuatro rRNA distintos, tres localizados en la subunidad grande y uno en la pequeña. En los seres humanos, la subunidad grande contiene moléculas de RNA 28S, 5.8S y 5S, y la pequeña un RNA 18S.¹ Varias nucleasas cortan tres de estos rRNA (los 28S, 18S y 5.8S) de un transcrito primario único (llamado pre-rRNA). Los rRNA 5S se sintetizan a partir de un RNA precursor diferente fuera del nucléolo. Primero se analizará el pre-rRNA.

El pre-rRNA se caracteriza por el gran número de nucleótidos metilados y de residuos de seudouridina que contiene, a diferencia de otros transcritos de RNA. Cuando un precursor de pre-rRNA humano se divide por primera vez, más de 100 grupos metilo ya se han añadido a las ribosas de la molécula y alrededor de 95 de sus residuos de uridina se convierten por modificación química en seudouridina (fig. 11.15a). El total de estas modificaciones ocurre después de que los nucleótidos se incorporan al RNA naciente, esto es, de manera postranscripcional. Los nucleótidos modificados se localizan en posiciones específicas, se agrupan en porciones definidas de la molécula y se conservan en todos los organismos. Todos los nucleótidos modificados en el pre-rRNA permanecen como parte de los productos finales, mientras que las secciones sin cambios se descartan durante el proceso. La función de los grupos metilo y las seudouridinas no es clara. Estos nucleótidos modificados pueden proteger partes del pre-rRNA del corte enzimático, promover el plegamiento del rRNA en su estructura tridimensional final o promover interacciones de los rRNA con otras moléculas.

Puesto que los rRNA están muy metilados, su síntesis puede analizarse tras incubar células con metionina marcada con etiquetas radiactivas, un compuesto que sirve en la mayoría de las células como donador de grupos metilo. Éstos se transfieren de la metionina a los nucleótidos de los pre-rRNA por medios enzimáticos. Cuando se añade metionina [¹⁴C] a células de mamífero cultivadas durante un periodo corto, una fracción considerable de la radiactividad incorporada se halla en una molécula de RNA 45S, con longitud de unos 13 000 nucleótidos. Los RNA 45S se cortan en moléculas pequeñas que entonces se convierten en moléculas maduras de rRNA 28S, 18S y 5.8S, cuya longitud combinada se aproxima a 7 000 nucleótidos, o un poco más de la mitad del transcrito primario.

Algunos de los pasos de la vía del procesamiento que transforma los pre-rRNA 45S en rRNA maduros pueden analizarse si se incuban células de mamífero con metionina marcada durante un periodo muy breve y se traspasan a un medio no marcado en diferentes lapsos (fig. 11.13). (Este tipo de experimentos de “pulso-caza” se revisa en la página 273). Como se indicó, las primeras especies que se utilizaron en este tipo de experimentos fueron los transcritos primarios 45S, los cuales se ven como picos de radiactividad (línea roja) en la fracción de RNA nucleolar después de 10 min. Después de 1 h, el RNA 45S ha desaparecido del nucléolo y lo reemplaza un RNA 32S, que es uno de los dos productos principales generados a partir del transcrito primario 45S. El RNA 32S se observa como un pico distinto en la fracción nucleolar desde los 40 hasta los 150 min y es un precursor de los rRNA maduros 28S y 5.8S. El otro producto principal del pre-rRNA 45S abandona el núcleo muy rápido y aparece en el citoplasma como rRNA 18S maduro (se observa a los 40 min en la fracción citoplásmica). Después de dos o más horas, casi toda la radiactividad ha abandonado el nucléolo y la mayoría se ha acumulado en el citoplasma en la forma de subunidades 28S y 18S de rRNA. La radiactividad en el pico del RNA 4S incluye al rRNA 5.8S y los grupos metilo transferidos a moléculas pequeñas de tRNA. La figura 11.14 muestra la vía común del procesamiento de un transcrito primario de rRNA.

Función de los snoRNA

El procesamiento de los pre-rRNA se completa con la ayuda de un gran número de RNA nucleolares pequeños (o snoRNA) que se adhieren a moléculas proteínicas particulares para formar partículas llamadas ribonucleoproteínas nucleolares pequeñas (snoRNP, small, nucleolar ribonucleoproteins). Micrografías electrónicas indican que las snoRNP comienzan a relacionarse con los precursores de rRNA antes de que éstos se transcriban por completo. La primera partícula de RNP que se une a un pre-rRNA contiene el snoRNA U3 y más de dos docenas de proteínas diferentes. Este componente importante de la maquinaria del procesamiento de rRNA puede verse como un balón que se une al extremo saliente de cada fibrilla naciente de RNA en la figura 11.11c, donde se cataliza la remoción del extremo 5′ del transcrito (fig. 11.14). Se cree que algunos de los cortes enzimáticos indicados en la figura 11.14 los cataliza un “exosoma”, que es una máquina que degrada el RNA y que posee alrededor de una docena de exonucleasas diferentes.

Hace algunos años se identificaron el U3 y otros snoRNA porque están presentes en grandes cantidades (cerca de 10⁶ copias por célula). Por el contrario, se descubrió una clase diferente de snoRNA presente en baja concentración (unas 10⁴ copias por célula). Se trata de snoRNA de menor abundancia que puede dividirse en dos grupos con base en su función y similitudes en su secuencia nucleotídica. Los miembros de un grupo (llamado snoRNA de caja C/D) determinan qué nucleótidos en el pre-rRNA se metilan en sus residuos de ribosa. En cambio, los miembros del otro grupo (denominado snoRNA de caja H/ACA) determinan qué uridinas se convierten en seudouridinas. Las estructuras de los nucleótidos modificados de estas dos reacciones se muestran en la figura 11.15a.

Los dos grupos de snoRNA contienen segmentos relativamente largos (de 10 a 21 nucleótidos) que son complementarios de secciones del transcrito de rRNA. Estos snoRNA son un excelente ejemplo de cómo los ácidos nucleicos de cadena sencilla tienen secuencias nucleotídicas complementarias capaces de formar híbridos bicatenarios. En este caso, cada snoRNA se une a una porción específica del pre-rRNA para formar un dúplex RNA-RNA. El snoRNA unido guía entonces a la enzima (sea una metilasa o una seudouridilasa) dentro del snoRNP para modificar un nucleótido en particular en el pre-rRNA. En conjunto suman alrededor de 200 snoRNA diferentes, uno para cada sitio en el pre-rRNA que esté seudouridilado o metilado en la ribosa. Si se elimina el gen que codifica a uno de estos snoRNA, uno de los nucleótidos del pre-rRNA no puede ser modificado de manera enzimática. Los mecanismos de acción de estos dos tipos de snoRNA se detallan en la figura 11.15b,c.

En el nucléolo ocurren el procesamiento del rRNA y el ensamble de dos subunidades ribosómicas. Se ha observado que más de 200 proteínas distintas se relacionan con el rRNA en diferentes fases del ensamblaje de un ribosoma. Es posible dividir tales polipéptidos en dos grupos: proteínas ribosómicas que permanecen en las subunidades y proteínas accesorias que tienen una interacción transitoria con los intermediarios del rRNA y se requieren sólo para el procesamiento. En este último grupo se incluyen más de una docena de helicasas de RNA, que son enzimas que desenrollan las regiones bicatenarias del ácido ribonucleico. Al parecer, dichas enzimas intervienen en muchos reordenamientos estructurales que ocurren durante la formación de los ribosomas, incluida la disociación de los snoRNA de las partículas pre-ribosómicas.

Síntesis y procesamiento del rRNA 5S

Un rRNA 5S, de unos 120 nucleótidos de largo, es parte de la subunidad ribosómica grande, sea de organismos procariotas o eucariotas. Un gran número de genes idénticos, separados de los otros genes de rRNA y localizados fuera del nucléolo, codifica en los eucariotas a las moléculas de rRNA 5S. Después de su síntesis, este RNA se transporta al nucléolo para unirse a otros componentes que participan en el ensamble de las subunidades ribosómicas.

Los genes del rRNA 5S son transcritos por la RNA polimerasa III. Esta enzima difiere de las otras polimerasas en que puede unirse a un sitio promotor situado dentro de la porción transcrita del gen blanco.² Esta región se demostró con claridad en experimentos en los que se utilizaron genes modificados del rRNA 5S transferidos a células hospedadoras y se determinó la capacidad de este DNA para servir como plantilla para la RNA polimerasa III del hospedador. De esa forma se encontró que la región flanqueadora 5′ podía eliminarse en su totalidad sin que la polimerasa dejara de transcribir el DNA en el sitio normal de inicio. Sin embargo, si la deleción incluía la parte central del gen, la polimerasa no transcribía el DNA ni se unía a éste. Si el promotor interno del gen rRNA 5S se inserta en otra región del genoma, el nuevo sitio se transforma en la plantilla para la transcripción por medio de la RNA polimerasa III.

RNA de transferencia

Se calcula que las células de plantas y de animales tienen cerca de 50 especies diferentes de RNA de transferencia, cada uno codificado por una secuencia repetida de DNA. El grado de duplicación varía de acuerdo con el organismo: las células de levadura tienen un total de 275 genes que codifican tRNA, las moscas de la fruta unos 850 y los seres humanos alrededor de 1 300. Los RNA de transferencia se sintetizan a partir de genes que se encuentran en pequeños agrupamientos diseminados en el genoma. Por lo común, un solo agrupamiento contiene múltiples copias de diferentes genes de tRNA y, por el contrario, la secuencia de DNA que codifica un tRNA específico se halla por lo general en más de un agrupamiento. Los DNA incluidos en esta región (tDNA) tienen sobre todo secuencias espaciadoras no transcritas y las secuencias codificantes para tRNA se sitúan en intervalos irregulares en un ordenamiento en tándem (fig. 11.16).

Al igual que los rRNA 5S, los tRNA se transcriben por medio de la RNA polimerasa III y la secuencia promotora se localiza dentro de la región codificante del gen en vez de en la región 5′ flanqueadora. El transcrito primario de una molécula de tRNA es mucho más grande que el producto final, por lo cual segmentos de los extremos 5′ y 3′ del precursor de tRNA (y en algunos casos una pequeña parte del interior) deben eliminarse. Además, muchas bases se modifican (fig. 11.42). Una de las enzimas que intervienen en el procesamiento del pre-tRNA es una endonucleasa conocida como ribonucleasa P, presente en bacterias y células eucariotas, formada por RNA y subunidades proteínicas. La subunidad de RNA de la ribonucleasa P que cataliza el corte del sustrato pre-tRNA se revisa en la sección “Vías experimentales” de este capítulo (pág. 478).

Cuando las células eucariotas se incuban por un corto periodo (30 min) en [³H]uridina o [³²P]fosfato y de inmediato se atenúan, la mayor parte de la radiactividad se incorpora en moléculas de RNA que tienen las siguientes propiedades: (1) muestran pesos moleculares altos (hasta 80S o 50 000 nucleótidos), (2) se representan como grupo por RNA diversos (heterogéneos) con distintas secuencias nucleotídicas y (3) se encuentran sólo en el núcleo. Por estas propiedades, dichos nucleótidos se conocen como RNA nucleares heterogéneos (hnRNA, heterogeneous nuclear RNAs), y se indican con la línea roja que representa la radiactividad en la figura 11.17a. Cuando las células incubadas con [³H]uridina o [³²P]fosfato durante un pulso breve se colocan en un medio sin marcas radiactivas, y se vigilan varias horas antes de atenuarlas y extraer el RNA, la cantidad de radiactividad en los RNA nucleares grandes decrece de modo notorio y aparece en mRNA mucho más pequeños en el citoplasma (línea roja en la figura 11.17b). Estos experimentos pioneros, iniciados por James Darnell Jr., Klaus Scherrer y col., sugirieron que los hnRNA grandes que se marcaban con rapidez eran principalmente precursores de los mRNA citoplásmicos más pequeños. Un gran cuerpo de investigación ha sustentado de manera inequívoca esta interpretación en los últimos 40 años.

Es importante notar que las líneas rojas y las azules de la figura 11.17 siguen un curso muy diferente. Las segundas, que indican la densidad óptica (p. ej., la absorbancia de la luz ultravioleta), proveen información acerca de la cantidad de RNA en cada fracción después de la centrifugación. A partir de los trazos de las líneas azules es evidente que la mayor parte del RNA en la célula está presente como rRNA 18S y 28S (junto con varios RNA pequeños que permanecen cerca de la parte superior del tubo). Las líneas rojas, que señalan la radiactividad en cada fracción, aportan datos sobre el número de nucleótidos radiactivos incorporados en los RNA de diferente tamaño durante un pulso breve. Estas gráficas evidencian que el hnRNA (fig. 11.17a) y el mRNA (fig. 11.17b) no constituyen una fracción significativa del RNA en la célula. Si esto fuera así, debería existir una gran correspondencia entre las líneas azules y las rojas. De esta forma, a pesar de que los mRNA (y sus precursores heterogéneos nucleares) son sólo una pequeña fracción del RNA total en la mayor parte de las células eucariotas, forman parte de un gran porcentaje del ácido ribonucleico sintetizado por una célula en cualquier momento (fig. 11.17a). Las razones de que exista poca o ninguna evidencia de hnRNA y mRNA en las gráficas de densidad óptica de la figura 11.17 apuntan a que estos RNA se degradan después de lapsos relativamente breves. Esto es en particular cierto para los hnRNA, que se transforman en mRNA o se degradan por completo, incluso mientras se sintetizan. En cambio, los rRNA y los tRNA tienen vidas medias que se miden en días o semanas y se acumulan de manera gradual para convertirse en las especies predominantes en la célula. Después de 3 h de rastreo puede detectarse cierto acopio de radiactividad en los rRNA maduros 28S y 18S (fig. 11.17b). Las semividas de los mRNA varían según las especies, y oscilan entre 15 min y algunos días.

Maquinaria para la transcripción del mRNA

Todos los precursores de mRNA eucariotas los sintetiza la RNA polimerasa II, una enzima compuesta de 12 subunidades diferentes que se han conservado en gran medida desde las levaduras hasta los mamíferos. La RNA polimerasa II se une al promotor con la cooperación de varios factores generales de transcripción (GTF, general transcription factors) para formar un complejo de preiniciación (PIC, preinitiation complex). A estas proteínas se les llama GTF porque son necesarias para la iniciación precisa de la transcripción de un conjunto diverso de genes en una gran variedad de organismos. Los elementos promotores que fomentan la nucleación del ensamble del PIC se encuentran en el lado 5′ de cada unidad de transcripción, aunque la enzima hace contacto con el DNA a ambos lados de la secuencia de inicio de transcripción (fig. 11.19b). Se analizarán sólo los promotores mejor estudiados, que son los que están vinculados con genes de tejidos específicos con expresión elevada, como el de la ovoalbúmina (que codifica la clara del huevo de gallina) y los de las globinas (que codifican los polipéptidos de la hemoglobina). Una parte importante de la región promotora de tales genes se encuentra entre 24 y 32 bases en dirección 5′ (corriente arriba) del sitio en el que se inicia la transcripción (fig. 11.18a). Esta región a menudo contiene una secuencia de consenso que es idéntica o muy parecida al oligonucleótido 5′-TATAAA-3′ y se conoce como caja TATA.

El primer paso en el ensamblaje del complejo de preiniciación es la unión de la proteína de unión a la secuencia TATA (TBP, TATA-binding protein), que reconoce a la caja TATA de los promotores eucariotas (fig. 11.18b). En consecuencia, como ocurre en las bacterias, una polimerasa eucariota purificada es incapaz por sí sola de reconocer un promotor de modo directo y no puede iniciar con precisión la transcripción. La TBP es una subunidad de un complejo proteínico mucho más grande llamado factor de transcripción para la polimerasa II, fracción D (TFIID, transcription factor for polymerase II, fraction D).³ La cristalografía de rayos X ha revelado que la unión de la TBP al promotor de la polimerasa II causa una distorsión espectacular de la conformación del DNA. Como se muestra en la figura 11.19a, la TBP se inserta por sí misma dentro del surco menor de la doble hélice de DNA y pliega a la molécula más de 80° en el sitio de interacción de las dos moléculas. Mientras la TBP se une a la caja TATA, otras subunidades del complejo TFIID se unen a regiones del DNA distintas, incluyendo elementos que se encuentran en dirección 3′ del sitio de inicio de la transcripción.

La unión del TFIID permite el ensamble del complejo de preinicio completo, el cual se cree que ocurre de manera secuencial como aparece en la figura 11.18b. La interacción de tres de los GTF (TBP de TFIID, TFIIA y TFIIB) con el DNA se muestra en la figura 11.19a. La presencia de estas tres proteínas unidas al promotor provee una plataforma para la unión posterior de la enorme multisubunidad de la RNA polimerasa con su TFIIF adherido (fig. 11.18b). Una vez que la RNA polimerasa-TFIIF se encuentra en posición, otro par de GTF (TFIIE y TFIIH) se une al complejo y convierte a la polimerasa en una máquina activa de transcripción. En la figura 11.19b se muestra un modelo tridimensional del complejo de preiniciación.

El TFIIH es el único GTF conocido que posee actividad enzimática. Una de las subunidades del TFIIH funciona como una proteína cinasa para fosforilar a la RNA polimerasa (se revisa más adelante), mientras que las otras dos subunidades funcionan como enzimas que desenrollan al DNA (helicasas). La actividad de DNA helicasa es necesaria para separar las cadenas en la región promotora, lo que hace posible que la polimerasa tenga acceso a la plantilla. Una vez que la transcripción comienza, algunos de los GTF (incluido el TFIID) pueden permanecer en el promotor, mientras que otros se liberan del complejo (fig. 11.20). Cuanto más tiempo permanezca el TFIID unido al promotor, más moléculas de RNA polimerasa pueden unirse a dicha región e iniciar nuevos procesos de transcripción sin retraso.

El dominio carboxilo terminal (CTD, carboxyl-terminal domain) de la subunidad más grande de la RNA polimerasa II tiene una estructura poco común, que consiste en una secuencia de siete aminoácidos (-Tyr1-Ser2-Pro3-Thr4-Ser5-Pro6-Ser7-) que se repite en múltiples ocasiones. En los seres humanos, el CTD está formado por 52 repeticiones de este heptapéptido. Los siete residuos pueden modificarse por medios enzimáticos; esta revisión se limita a las serinas 2 y 5, que son los residuos que se fosforilan por efecto de las cinasas de proteínas. La RNA polimerasa que se ensambla en el complejo de preiniciación no está fosforilada, en tanto que la misma enzima que se compromete con la transcripción cuenta con numerosos grupos fosfato en el CTD (fig. 11.20). La fosforilación de este dominio puede catalizarse al menos con cuatro cinasas de proteínas diferentes, incluido el TFIIH, que fosforila los residuos de serina en la posición #5. La fosforilación de la polimerasa por acción del TFIIH puede actuar como el evento desencadenante que desacopla la enzima de los GTF, del promotor de DNA o de ambos, lo que permite que la enzima escape del complejo de preiniciación y se desplace por la plantilla de DNA. En las fases incipientes de la transcripción el CTD es fosforilado en las posiciones Ser5, con lo cual se dispone de sitios de unión para proteínas que intervienen en las fases más tempranas del procesamiento de mRNA, como la formación del casquete 5′ (fig. 11.34). Conforme la RNA polimerasa se desplaza por el gen que se está transcribiendo, otra cinasa (P-TEFb) fosforila el CTD en los residuos de serina en la posición #2 (como en la fig. 11.34). Se cree que este cambio en el patrón de fosforilación facilita el reclutamiento de factores proteínicos adicionales implicados en el corte y empalme del RNA y la adición de la cola poli(A), como se revisa más adelante. De esta manera, el CTD actúa como plataforma para la ganancia y pérdida dinámica de los factores necesarios para la formación de un mRNA maduro. Según algunas estimaciones, una RNA polimerasa II en proceso de elongación podría contener más de 50 componentes y tener una masa molecular de más de tres millones de daltones.

No se comprende bien la forma en la que la RNA polimerasa II termina la transcripción. No hay evidencia de que el DNA de los genes codificadores de proteínas contenga secuencias de terminación bien definidas como en las células bacterianas. En realidad, una RNA polimerasa II en transcripción puede viajar una distancia variable y extensa después del punto que genera el extremo 3′ del mRNA procesado. Por lo tanto, a diferencia de las bacterias en que el extremo 3′ del mRNA se genera sólo por terminación de la transcripción, en las eucariotas éste se forma por una serie separada de fases de procesamiento (pág. 448).

En conjunto, la RNA polimerasa II y sus GTF son suficientes para promover un nivel basal bajo de transcripción de la mayor parte de los promotores in vitro. Como se revisa con detalle en el capítulo 12, diferentes factores de transcripción específicos son capaces de unirse a numerosos sitios en las regiones reguladoras del DNA. Estos elementos pueden determinar: (1) si un complejo de preiniciación se ensambla o no en un promotor en particular y (2) la velocidad a la cual la polimerasa inicia nuevos ciclos de transcripción desde dicho promotor. Antes de analizar el mecanismo por medio del cual se generan los mRNA, primero se describe la estructura de estos para clarificar las razones de algunos de los pasos de su procesamiento.

Estructura de los mRNA

Los mRNA comparten ciertas propiedades:

1. Contienen secuencias continuas de nucleótidos que codifican un polipéptido específico.

2. Se encuentran en el citoplasma.

3. Se unen a los ribosomas cuando se traducen.

4. La mayor parte de los mRNA contiene un segmento no codificador significativo, es decir, una porción que no rige el ensamble de aminoácidos. Por ejemplo, cerca de 25% de cada mRNA de globina consiste en regiones no codificadoras que no se traducen (fig. 11.21). Dichas porciones se encuentran en los extremos 5′ y 3′ de un mRNA y contienen secuencias que tienen funciones reguladoras de importancia (sección 12.6).

5. Los mRNA eucariotas tienen modificaciones especiales en sus extremos 5′ y 3′ que no se encuentran ni en los mensajeros procariotas ni en los RNA de transferencia o ribosómicas. El extremo 3′ de casi todos los mRNA eucariotas posee una secuencia de 50 a 250 residuos de adenosina que forman una cola poli(A), en tanto que el extremo 5′ tiene un casquete de guanosina metilado (fig. 11.21).

Pronto se volverá a este tema para describir el modo en que los mRNA adquieren sus extremos 5′ y 3′ especializados. Sin embargo, primero es necesaria una breve desviación para comprender cómo se forman los mRNA en la célula.

Genes interrumpidos: un hallazgo inesperado

Tan pronto se descubrieron los hnRNA, se propuso que este grupo de ácidos nucleicos que se marcan con rapidez era el precursor de los mRNA citoplásmicos (pág. 434). El punto más importante fue la diferencia de tamaño entre las dos poblaciones de RNA: los hnRNA eran varias veces más grandes que los mRNA (fig. 11.22). ¿Por qué deberían las células sintetizar grandes moléculas precursoras de las versiones más pequeñas? Estudios iniciales sobre el procesamiento del RNA ribosómico habían mostrado que los RNA maduros procedían de grandes moléculas primordiales. Hay que recordar que es necesario remover grandes segmentos de los extremos 5′ y 3′ de diferentes rRNA intermediarios (fig. 11.14) para generar al final un rRNA maduro. Con base en el esquema anterior se pensaba que la célula seguía una vía similar para el procesamiento de hnRNA para formar mRNA. Sin embargo, los mRNA constituyen una población tan diversa que era imposible seguir los pasos del procesamiento de una sola especie de mRNA, como se había intentado para los rRNA. El problema lo resolvió un descubrimiento inesperado.

Hasta el año 1977, los biólogos moleculares asumían que una secuencia lineal y continua de nucleótidos en un mRNA era complementaria de una secuencia igual localizada en una cadena del DNA de un gen. En ese año Phillip Sharp, Susan Berget y colaboradores, del Massachusetts Institute of Technology, y Richard Roberts, Louise Chow y su equipo de investigadores de los Cold Spring Harbor Laboratories de Nueva York, realizaron un importante hallazgo. Encontraron que los mRNA estudiados se transcribían a partir de segmentos de DNA separados unos de otros a lo largo de la plantilla.

Las primeras observaciones en verdad relevantes se hicieron durante el análisis de la transcripción del genoma del adenovirus, un patógeno capaz de infectar a gran número de células de mamífero. Se encontró que varios mRNA diferentes tenían la misma secuencia de 150 a 200 nucleótidos en el extremo 5′. Era de esperarse que tal secuencia líder representara un segmento repetido de nucleótidos localizado cerca de la región promotora de cada uno de los genes que codifican a estos mRNA. Sin embargo, análisis posteriores revelaron que la secuencia líder 5′ no es complementaria de una secuencia repetida ni de un tramo continuo de nucleótidos en la plantilla de DNA, sino que se transcribe a partir de tres segmentos de DNA distintos y separados (representados por los bloques x, y y z en la figura 11.23). Las regiones del DNA situadas entre estos segmentos, llamadas secuencias interpuestas (I₁ a I₃ en la fig. 11.23), están ausentes por alguna razón en el mRNA correspondiente. Se podría argumentar que la presencia de secuencias interpuestas es una peculiaridad de los genomas virales, pero esta observación básica pronto se amplió a los genes celulares.

En 1977, Alec Jeffreys y Richard Flavell en Holanda, y Pierre Chambon en Francia, notificaron por primera vez la presencia de secuencias interpuestas en genomas celulares no víricos. Jeffreys y Flavell descubrieron una secuencia interpuesta de unas 600 bases situada directamente dentro de una parte del gen de la globina que codificaba la secuencia de aminoácidos de dicho polipéptido (fig. 11.24); la base de este hallazgo se revisa en el pie de figura mencionada. Pronto se reconocieron secuencias interpuestas en otros genes y resultó evidente que la presencia de éstos, llamados genes interrumpidos, es la regla y no la excepción. Las partes de un gen que contribuyen a la formación de un RNA maduro se conocen como exones, en tanto que las secuencias interpuestas se denominan intrones. Los genes interrumpidos aparecen en las eucariotas, aunque los intrones de organismos más simples de este tipo (p. ej., levaduras y nematodos) casi siempre muestran un número y tamaño menores en comparación con plantas y animales. Los intrones se encuentran en todos los tipos de genes, incluidos los que codifican a los tRNA, rRNA y mRNA.

El descubrimiento de genes con intrones dio paso inmediato a preguntarse de qué forma éstos eran capaces de producir los mRNA que carecían de estas secuencias. Una posibilidad era que las células generaran un transcrito primario correspondiente a toda la unidad de transcripción y que las porciones de RNA de los intrones del DNA se eliminaran de alguna manera. Si éste era el caso, entonces en el transcrito primario deberían estar presentes los segmentos correspondientes a los intrones. Tal razonamiento también debía explicar por qué los hnRNA tenían un tamaño mucho mayor que el de los mRNA que producían.

La investigación enfocada en el RNA nuclear ha continuado en los últimos años a tal grado que se han determinado las dimensiones de unos cuantos precursores de mRNA (pre-mRNA). Por ejemplo, se observó que la secuencia de globina está presente en una molécula de RNA nuclear que se sedimenta a 15S, a diferencia del mRNA de la globina final cuyo coeficiente de sedimentación es de 10S. Para ello Shirley Tilghman, Philip Leder y colaboradores, de los National Institutes of Health, utilizaron una técnica ingeniosa (conocida como formación del asa R), para determinar la relación física que existe entre los RNA de globina 15S y 10S y generar información sobre la transcripción de los genes interrumpidos.

Hay que recordar la evidencia analizada en la página 400, según la cual las cadenas simples de DNA complementarias pueden unirse de manera específica entre sí. También se enlazan el DNA monocatenario y las moléculas de RNA, siempre y cuando tengan secuencias complementarias de nucleótidos; ésta es la base de la técnica de hibridación entre DNA y RNA analizada en la sección 18.10 (el complejo DNA-RNA se conoce como híbrido). Tilghman y colaboradores recurrieron a la microscopia electrónica para examinar un fragmento de DNA que contenía el gen de la globina hibridado con el RNA 15S de dicha proteína. Se advirtió que el híbrido estaba formado por un complejo bicatenario de DNA-RNA continuo (las líneas punteadas rojas y azules de la figura 11.25a). En cambio, cuando el mismo fragmento de DNA se incubó con el mRNA 10S maduro de la globina, se observó que un largo segmento de DNA en el centro de la región codificante protruía formando un asa bicatenaria (fig. 11.25b), que estaba formada por un gran intrón en el DNA que no era complementario del mRNA pequeño de la globina en ninguna parte. Fue evidente que el RNA 15S contenía los segmentos correspondientes a los intrones de los genes que se eliminan durante la formación del mRNA 10S.

Casi al mismo tiempo se efectuó un experimento similar de hibridación entre el DNA que codifica a la ovoalbúmina, una proteína que se encuentra en los huevos de la gallina, y su correspondiente mRNA. El híbrido de dichas moléculas contiene siete asas distintas que corresponden a siete intrones (fig. 11.26). En conjunto, éstos representan cerca de tres veces el DNA presente en las ocho porciones codificantes combinadas (exones). Estudios posteriores han revelado que los exones individuales promedian alrededor de 165 nucleótidos. En cambio, los intrones tienen cerca de 3 500 nucleótidos, lo cual explica porque las moléculas de hnRNA son mucho más largas que los mRNA. Para citar dos casos extremos, el gen de la distrofina humana tiene 100 veces la longitud necesaria para codificar a su correspondiente mRNA y el gen del colágeno de tipo I contiene más de 50 intrones. El gen humano promedio contiene alrededor de nueve intrones, que conforman más de 95% de la unidad de transcripción.

Estos y otros hallazgos proporcionaron evidencias sólidas para la propuesta según la cual la formación del mRNA en células eucariotas sucede por la eliminación de secuencias internas de ribonucleótidos de un pre-mRNA mucho más largo. A continuación se analizan los pasos de este proceso.

Procesamiento de los mRNA eucariotas

La RNA polimerasa II genera un transcrito primario que es complementario del DNA de toda la unidad de transcripción. El examen con microscopia electrónica de genes en proceso de transcripción, indica que los RNA producidos se vinculan con diferentes proteínas y partículas más grandes, incluso mientras se sintetizan (fig. 11.27). Tales partículas, que consisten en proteínas y ribonucleoproteínas, incluyen a los agentes encargados de convertir al transcrito primario en un mRNA maduro. Este proceso de conversión requiere la adición de un casquete 5′ y una cola poli(A) 3′ a los extremos del transcrito, además de la eliminación de cualquier secuencia intrónica. Una vez completo el procesamiento, el mRNP, que consta de mRNA y proteínas relacionadas, está listo para exportarse del núcleo.

Casquetes 5′ y colas poli(A) 3′

Los extremos 5′ de todos los RNA poseen al principio un trifosfato derivado del primer nucleósido trifosfatado que se incorporó en el sitio de iniciación de la síntesis de RNA. Una vez que se sintetiza el extremo 5′ de un precursor de mRNA, diferentes actividades enzimáticas actúan en esta región de la molécula (fig. 11.28). En el primer paso, el último de los tres fosfatos se elimina, convirtiendo al extremo 5′ en un difosfato (paso 1, fig. 11.28). Después se agrega un GMP en una orientación invertida, de tal modo que el extremo 5′ de la guanosina apunte hacia el extremo 5′ de la cadena de RNA (paso 2, fig. 11.28). Como resultado, los dos primeros nucleósidos se encuentran unidos por un puente 5′-5′ de trifosfato poco usual. Por último, la guanosina terminal invertida se metila en la posición 7 de su base de guanina, mientras el nucleótido en el lado interno del puente de trifosfato lo hace en la posición 2′ de la ribosa (paso 3, fig. 11.28). El extremo 5′ del RNA contiene entonces un capuchón (casquete) de metilguanosina (que se muestra con mayor detalle en la figura 11.21). Estas modificaciones enzimáticas del extremo 5′ del transcrito primario ocurren con gran rapidez, mientras la molécula de RNA aún está siendo sintetizada. De hecho, el CTD fosforilado de la polimerasa recluta a las enzimas que generan el casquete (fig. 11.34). Éste tiene diferentes funciones: impide que las exonucleasas digieran al extremo 5′ del mRNA, favorece el transporte de éste hacia afuera del núcleo y tiene una participación importante en el inicio de la traducción del mensajero.

Como se ha visto, el extremo 3′ de un mRNA contiene una cadena de residuos de adenosina que forma una cola poli(A). Conforme se secuenciaron diferentes mRNA, resultó evidente que dicha estructura comienza por lo general unos 10 a 30 nucleótidos en dirección 3′ de la secuencia AAUAAA. En el transcrito primario, esta secuencia funciona como sitio de reconocimiento para el ensamble de un gran complejo de proteínas que procesan el extremo 3′ del mRNA (fig. 11.28). El complejo de procesamiento del ensamblado de la cola de poli(A) (poliadenilato) también se relaciona de manera física con la RNA polimerasa II cuando ésta sintetiza al transcrito primario (fig. 11.34).

Dentro de las proteínas del complejo de procesamiento se encuentra una endonucleasa (fig. 11.28, parte superior), que corta a la molécula de pre-mRNA en dirección 3′ respecto del sitio de reconocimiento. Luego, una enzima conocida como polimerasa de poli(A) agrega 250 o más adenosinas sin la necesidad de una plantilla (pasos a-c, fig. 11.28). Como se señala en la sección 12.6, la cola poli(A) y una proteína adjunta protegen al mRNA de la degradación prematura por exonucleasas. Es importante destacar que muchos genes tienen más de una secuencia de reconocimiento de poli(A) en sus segmentos no codificadores 3′. Dichos genes pueden transcribirse en mRNA cuyos segmentos no codificadores 3′ (3′ UTR, 3′ untranslated regions) tienen longitudes diferentes y por lo tanto, pueden responder a distintas influencias reguladoras.

Corte y empalme del RNA: eliminación de intrones de un pre-RNA

Los pasos clave en el procesamiento del pre-mRNA se muestran en la figura 11.29. Además de la formación del casquete 5′ y de la cola poli(A), ya descrita, las partes de un transcrito primario que corresponden a las secuencias intrónicas deben eliminarse por un proceso complejo denominado corte y empalme del RNA. Para procesar un RNA deben efectuarse cortes en los extremos 5′ y 3′ de la cadena (o sitios de corte y empalme) de cada intrón y los exones situados a cada lado de los sitios de empalme deben unirse (ligarse) de manera covalente de nueva cuenta. Es importante que el procesamiento ocurra con exactitud, porque la adición o la pérdida de un solo nucleótido en cualquiera de las uniones de empalme podrían causar que el mRNA resultante se tradujera de modo equívoco.

¿De qué manera la maquinaria básica de corte y empalme reconoce los límites entre los exones y los intrones en miles de pre-mRNA diferentes? El análisis de cientos de uniones entre exones e intrones en eucariotas, desde levaduras e insectos hasta mamíferos, revela la presencia en los sitios de corte y empalme de una secuencia nucleotídica conservada y originada en la evolución ancestral. En la figura 11.30 se muestra la secuencia identificada más a menudo en los bordes de la unión exón-intrón de las moléculas de pre-mRNA de mamífero. El componente G/GU en el sitio 5′ terminal del intrón (sitio de corte y empalme 5′), el elemento AG/G en el extremo 3′ del intrón (sitio de corte y empalme 3′) y la secuencia de polipirimidinas cercana al sitio de corte y empalme 3′ están presentes en la mayor parte de las moléculas de pre-mRNA eucariotas.⁴ Además, las regiones adyacentes del intrón contienen nucleótidos preferidos, como se indica en la figura 11.30, los cuales poseen una función relevante en el reconocimiento del sitio de corte y empalme. Las secuencias ilustradas en la figura 11.30 son necesarias para el reconocimiento de los sitios de corte y empalme, pero no son suficientes. Por lo general, los intrones poseen miles de nucleótidos y a menudo contienen segmentos internos que se asemejan a la secuencia de consenso mostrada en la figura 11.30, sin embargo las células no los reconocen como señales de corte y empalme, y en consecuencia, los ignoran. La adición de señales que le permiten a la maquinaria de corte y empalme distinguir entre exones e intrones se debe quizás a secuencias específicas, en particular los potenciadores del corte y empalme exónico (ESE, exonic splicing enhancers), situadas dentro de los exones (fig. 11.32, recuadro A). Cambios de la secuencia de DNA dentro del sitio de corte y empalme o en un ESE pueden provocar la inclusión de un intrón o la exclusión de un exón. Se calcula que cerca de 15% de las enfermedades humanas hereditarias es resultado directo de mutaciones que alteran el corte y empalme del pre-mRNA. Además, gran parte de la variación genética “normal” en la susceptibilidad a las enfermedades frecuentes en la población humana (pág. 417) podría deberse a los efectos de esta alteración en la eficiencia del corte y empalme del RNA.

El entendimiento del corte y empalme del RNA ha permitido tener una mejor apreciación de las sobresalientes capacidades de las moléculas de RNA. Thomas Cech y col., de la University of Colorado, obtuvieron en 1982 la primera evidencia de que las moléculas de RNA eran capaces de catalizar reacciones químicas. Como se revisa de forma más extensa en la sección “Vías experimentales” de este capítulo, estos investigadores encontraron que el protozoario ciliado Tetrahymena sintetizaba un precursor de rRNA (un pre-rRNA) capaz de eliminar sus propios intrones. Además de revelar la existencia de las enzimas de RNA, o ribozimas, tales experimentos cambiaron el pensamiento de los biólogos acerca de las funciones esenciales del RNA y las proteínas en el mecanismo del corte y empalme del RNA.

El intrón del pre-rRNA de Tetrahymena es un ejemplo de un intrón del grupo I, el cual no se revisará. Más tarde se descubrió otro tipo de intrones que se eliminan a sí mismos, llamados intrones del grupo II, en mitocondrias de hongos, cloroplastos de plantas y una amplia variedad de bacterias y arquebacterias. Estos intrones se pliegan en una estructura compleja que se muestra en dos dimensiones en la figura 11.31a. Dichas secuencias se eliminan a sí mismas al pasar por un estado intermedio, conocido como lazo (fig. 11.31b) porque se asemeja a la soga utilizada por los vaqueros para lazar vacas. El primer paso es la división del sitio de corte 5′ (paso 1, figura 11.31b), seguida por la formación de un lazo a través de un enlace covalente entre el extremo 5′ y un residuo de adenosina cercano al extremo 3′ del intrón (paso 2). La división subsiguiente del sitio de corte 3′ libera el lazo y hace posible que los extremos de los exones se unan (liguen) de modo covalente (paso 3).

Los pasos llevados a cabo durante la eliminación de los intrones de las moléculas de pre-mRNA en células eucariotas son muy similares a los observados en los intrones del grupo II. La diferencia primaria radica en que los pre-mRNA no son capaces de cortarse y empalmarse por sí mismos y requieren un grupo de RNA nucleares pequeños (snRNA) y sus proteínas accesorias. Conforme cada molécula larga de hnRNA se transcribe, se relaciona con un gran número de proteínas para formar una ribonucleoproteína nuclear heterogénea (hnRNP, heterogeneous nuclear ribonucleoprotein), la cual representa el sustrato para las reacciones siguientes. El procesamiento que ocurre en cada intrón del pre-mRNA se vincula con una dinámica máquina macromolecular llamada empalmosoma. Cada empalmosoma posee diferentes proteínas y un número de distintas partículas ribonucleoproteínicas, conocidas como ribonucleoproteínas nucleares pequeñas (snRNP, small nuclear ribonucleoproteins) porque están compuestas de snRNA unidos a proteínas específicas. Los empalmosomas no están prefabricados dentro del núcleo, sino que se ensamblan del mismo modo que se unen sus snRNP al pre-mRNA. Una vez que la maquinaria del empalmosoma se ensambla, las snRNP llevan a cabo las reacciones que cortan los intrones del transcrito y unen los extremos de los exones. Los intrones excluidos, que constituyen más de 95% de un pre-mRNA de mamífero promedio, simplemente se degradan en el núcleo.

La comprensión de los pasos implicados en el corte y empalme del RNA se ha logrado en gran medida gracias a estudios sobre extractos sin células, que pueden procesar con precisión pre-mRNA in vitro. Algunos de los principales pasos en el ensamblaje de un empalmosoma y la eliminación de un intrón se describen con detalle en la figura 11.32. La exclusión de un intrón requiere de varias partículas de snRNP: las snRNP U1, U2, U5, y U4/U6, la cual contiene los snRNA U4 y U6 unidos entre sí. Además de su snRNA, cada snRNP contiene una docena de proteínas o más. La familia de proteínas Sm está presente en todos los snRNP. Dichas moléculas Sm se unen entre sí y a un sitio conservado de cada snRNA (excepto el snRNA U6) para formar el núcleo de la snRNP. La figura 11.33 muestra un modelo estructural de la snRNP U1, donde se indica la localización de los snRNA, las proteínas Sm y otras proteínas dentro de la partícula. Las proteínas Sm se identificaron primero porque son el blanco de anticuerpos generados en pacientes con una enfermedad autoinmunitaria conocida como lupus eritematoso sistémico. Las otras proteínas de las snRNP son únicas para cada partícula.

Los sucesos descritos en la figura 11.32 proveen excelentes ejemplos de las interacciones dinámicas y complejas que pueden ocurrir entre las moléculas de RNA. Los reordenamientos múltiples de estas moléculas, que ocurren durante el ensamble de un empalmosoma, son mediados sobre todo por helicasas de RNA consumidoras de ATP, presentes dentro de las snRNP. Estas enzimas pueden desenrollar los RNA bicatenarios, como el dúplex U4-U6 del recuadro B de la figura 11.32, el cual permite que los RNA desplazados se unan a nuevas moléculas. Se cree que las helicasas de empalmosoma también eliminan las proteínas unidas a los RNA, incluida la proteína U2AF de la figura 11.32, recuadro A. Por lo menos ocho helicasas diferentes se han implicado en el corte y empalme del pre-mRNA en las levaduras.

Dos hallazgos sugirieron que los snRNA eran los componentes con actividad catalítica de los snRNP, y no las proteínas: (1) los pre-mRNA se procesan por el mismo par de reacciones químicas que ocurren cuando los intrones del grupo II se eliminan a sí mismos y (2) los snRNA necesarios para el corte y empalme de los pre-mRNA se asemejan a partes de los intrones del grupo II. De acuerdo con este escenario, el empalmosoma actuaría como una ribozima y las proteínas tendrían varias funciones complementarias, como el mantenimiento de la estructura tridimensional apropiada de los snRNA y la selección de los sitios de corte y empalme que van a usarse durante el procesamiento de un pre-mRNA particular. De los diversos snRNA que participan en el corte y empalme del RNA, U6 se considera el candidato más probable para la especie catalítica. Sin embargo, estudios recientes situaron al menos una de las proteínas de la snRNP U5 (una proteína llamada Prp8) muy cerca del sitio catalítico del empalmosoma. Además, Prp8 contiene un dominio RNasa que podría ser adecuado para dividir el pre-mRNA. Este hallazgo renovó la propuesta de que la acción combinada del RNA y un componente proteínico del empalmosoma es lo que cataliza las dos reacciones químicas necesarias para el corte y empalme del RNA.

Antes se mencionó que secuencias situadas dentro de los exones, llamadas potenciadores del corte y empalme exónico (ESE), participan de manera importante en el reconocimiento de exones por parte de la maquinaria de corte y empalme. Los ESE sirven como sitios de adhesión para una familia de moléculas peptídicas que se unen al RNA, conocidas como proteínas SR (llamadas así por el gran número de dipéptidos de arginina [R] y serina [S]). Se cree que estas proteínas forman redes interactivas que abarcan las fronteras intrón/exón y ayudan a reclutar snRNP en los sitios de corte y empalme (fig. 11.32, recuadro A). Las proteínas SR con carga positiva también se pueden unir por medio de fuerzas electrostáticas a los grupos fosfato con carga negativa que se agregan al CTD de la polimerasa cuando la transcripción se inicia (fig. 11.20). Como resultado, el ensamblaje de la maquinaria de corte y empalme en un intrón ocurre junto con la síntesis de este último por parte de la polimerasa. Se piensa que el CTD recluta a una amplia variedad de factores de procesamiento. De hecho, la mayor parte de la maquinaria que se requiere para el procesamiento del mRNA, y para su exportación al citoplasma, viaja con la polimerasa como parte de una gran “fábrica de mRNA” (fig. 11.34).

En virtud de que la mayoría de los genes contiene varios intrones, las reacciones de corte y empalme mostradas en la figura 11.32 deben ocurrir en múltiples ocasiones sobre un mismo transcrito primario. La evidencia sugiere que los intrones se eliminan de acuerdo con un orden determinado y que se generan intermediarios de procesamiento específicos cuyo tamaño se encuentra entre el del transcrito primario y el del mRNA maduro. En la figura 11.35 se muestra un ejemplo de intermediarios formados durante el procesamiento nuclear del mRNA ovomucoide en células del oviducto de gallina.

Implicaciones evolutivas de los genes interrumpidos y del corte y empalme del RNA

El hallazgo de la capacidad del RNA para catalizar reacciones químicas tuvo un enorme efecto sobre el concepto de la evolución biológica. Desde el descubrimiento del DNA como material genético, los biólogos se han preguntado qué surgió primero, las proteínas o el DNA. El dilema procede de las funciones al parecer no superpuestas de estos dos tipos de macromoléculas. Los ácidos nucleicos almacenan información, en tanto que las proteínas catalizan reacciones. Con el descubrimiento de las ribozimas a principios de la década de 1980 resultó evidente que el RNA podía hacer ambas cosas.

Estos hallazgos alimentaron la creencia de que el DNA y las proteínas estaban ausentes en la etapa inicial de la evolución de la vida. Durante este periodo, las moléculas de RNA ejecutaron una doble tarea: sirvieron como material genético y como catalizadores de reacciones químicas, incluidas las necesarias para la replicación del RNA. En esta etapa, la vida podía describirse como “un mundo de RNA”. Sólo en la última fase de la evolución, las proteínas y el DNA adquirieron las funciones de catálisis y almacenamiento de la información, en dicho orden; el RNA sólo conservó la función primaria de intermediario en el flujo de información genética. Muchos investigadores piensan que el corte y empalme representa un ejemplo de un legado de un mundo antiguo de RNA.

Aunque la presencia de los intrones es una carga adicional para las células, puesto que deben eliminar estas secuencias interpuestas de sus transcritos, los intrones tienen sus virtudes. Como se describe en el siguiente capítulo, el corte y empalme del RNA es uno de los pasos sometidos a regulación celular en la vía para formar mRNA. Muchos transcritos primarios pueden procesarse a través de dos o más vías, de modo que una secuencia que actúa como intrón en una vía, se puede convertir en exón en otra. Como resultado de este proceso, denominado corte y empalme alternativos, el mismo gen puede codificar más de un polipéptido.

Se piensa que la presencia de intrones ha tenido un gran efecto en la evolución biológica. Cuando se examina la secuencia de aminoácidos de una proteína, se encuentra a menudo que contiene secciones que son homólogas de diferentes partes de otras proteínas (véanse ejemplos en las figuras 2.36 y 7.22). Las proteínas de este tipo las codifican genes que casi con certeza son compuestos formados de partes de otros genes. El movimiento de los “módulos” genéticos entre genes no relacionados (un proceso conocido como intercambio exónico) se facilita en gran medida por la presencia de intrones, que actúan como elementos espaciadores inertes entre los exones. Los reordenamientos genéticos requieren la rotura de las moléculas de DNA, que puede ocurrir dentro de los intrones sin introducir mutaciones capaces de alterar al organismo. Con el tiempo, los exones pueden intercambiarse de forma independiente a través de diferentes mecanismos y ello posibilita un número casi infinito de combinaciones en la búsqueda de secuencias codificadoras nuevas y útiles. Como resultado de este intercambio de exones, la evolución no necesita ocurrir sólo por la lenta acumulación de mutaciones puntuales, sino que también puede avanzar mediante “saltos cuánticos” con proteínas nuevas que aparecen en una sola generación.

Creación de nuevas ribozimas en el laboratorio

En la mente de muchos biólogos el principal punto de discusión respecto de la posibilidad de un mundo de RNA en el cual esta molécula actúe como único catalizador, señala que hasta ahora sólo se han encontrado unas cuantas reacciones mediadas por los RNA que están presentes de manera natural en las células. Éstas incluyen la interrupción y el ligamiento de los enlaces fosfodiéster necesarios para el corte y empalme del RNA y la formación de enlaces peptídicos durante la síntesis de proteínas. ¿Acaso las moléculas de RNA pueden catalizar sólo estos tipos de reacciones o la evolución ha restringido su espectro catalítico de modo notorio a proteínas enzimáticas más eficientes? Diferentes grupos de investigadores exploran el potencial catalítico del RNA por medio de la creación de nuevas moléculas de ácido ribonucleico en el laboratorio. A pesar de que estos experimentos nunca demostrarán que tales moléculas existieron en los organismos antiguos, proporcionan pruebas del principio según el cual dichos elementos pudieron evolucionar a través de un proceso de selección natural.

En una de las estrategias los investigadores crearon RNA catalíticos a partir de sus componentes básicos, sin un diseño preconcebido para la construcción de dichos ácidos nucleicos. Los RNA se producen permitiendo que máquinas sintetizadoras ensamblen DNA con secuencias nucleotídicas aleatorias. La transcripción de estos DNA crea una población de RNA cuyas secuencias nucleotídicas se determinan también de modo aleatorio. Tras obtener una población de RNA, miembros individuales pueden seleccionarse gracias a las propiedades particulares que poseen. Esta conducta se describe como “evolución en tubo de ensayo”.

En un grupo de estudios, los investigadores seleccionaron al inicio RNA que se unieran a aminoácidos específicos y escogieron una subpoblación que transfiriera un aminoácido específico al extremo 3′ de un tRNA diana. Esta es la misma reacción básica que efectúan las aminoacil-tRNA sintetasas, que son enzimas capaces de unir los aminoácidos a los tRNA necesarios para la síntesis proteínica (pág. 466). Se ha conjeturado que los aminoácidos pudieron utilizarse de manera inicial como cofactores para potenciar las reacciones catalíticas que llevan a cabo las ribozimas. Con el tiempo, es posible que éstas evolucionaran y fueran capaces de unir aminoácidos específicos entre sí para formar pequeñas proteínas, más versátiles en la catálisis que sus RNA predecesores. Como se describe más adelante en este capítulo, los ribosomas (las máquinas de ribonucleoproteínas encargadas de la síntesis de moléculas peptídicas) son en esencia ribozimas, las cuales proveen una base importante para este escenario evolutivo. A medida que las proteínas asumieron gran parte del trabajo en las células primitivas, el mundo de RNA se transformó de manera gradual en un “mundo de RNA y proteínas”. En un punto más tardío, es probable que el DNA reemplazara al RNA como material genético e impulsara las formas de vida del presente “mundo de DNA, RNA y proteínas”. La evolución del DNA pudo necesitar sólo dos tipos de enzimas: una reductasa de ribonucleótido para convertir los ribonucleótidos en desoxirribonucleótidos y una transcriptasa inversa para transcribir el RNA en DNA. El hecho de que RNA catalíticos no parezcan intervenir en la síntesis o la transcripción del DNA, apoya la idea de que éste fue el último miembro de la tríada DNA-RNA-proteína que apareció en escena.

En alguna parte del curso evolutivo, un código tuvo que desarrollarse para permitir que el material genético codificara la secuencia de los aminoácidos que se debían incorporar en una proteína particular. La naturaleza de este código es el tema de la última sección de este capítulo.

La idea de que moléculas de RNA intervienen de forma directa en la regulación de la expresión génica comenzó con una observación intrigante. En general los pétalos de las petunias son de color púrpura claro. En 1990, dos grupos de investigadores informaron un intento de intensificar el color de las flores mediante la introducción de copias extra de un gen que codifica una enzima productora de pigmento. Para sorpresa de los científicos, la presencia de los genes adicionales hizo que los pétalos perdieran su pigmentación en vez de intensificarla, como se esperaba (fig. 11.36a). Estudios posteriores indicaron que, bajo esas condiciones experimentales, tanto los genes agregados como sus contrapartes normales dentro del genoma se transcribían, pero los mRNA resultantes estaban un tanto degradados. Este fenómeno llegó a conocerse como desactivación génica postranscripcional (PTGS; posttranscriptional gene silencing).

Fue hasta 1998 cuando se comprendió la base molecular de esta forma de desactivación génica. En ese año, Andrew Fire, del Carnegie Institute of Washington, y Craig Mello y colaboradores de la University of Massachusetts, realizaron un experimento en el nematodo C. elegans. Inyectaron a estos gusanos varias preparaciones diferentes de RNA con la esperanza de detener la síntesis de una proteína muscular específica. Uno de los preparados contenía RNA “codificante”, es decir, con la secuencia del mRNA que codificaba la proteína de interés; otro preparado contenía RNA “no codificante”, con la secuencia complementaria a la del mRNA en cuestión; y un tercer preparado constaba de un RNA de doble cadena que contenía ambas secuencias unidas entre sí.

Ninguno de los ácidos nucleicos de cadena sencilla tuvo mucho efecto, pero el RNA bicatenario fue muy eficaz para detener la producción de la proteína codificada. Fire y Mello describieron el fenómeno como interferencia del RNA (RNAi, RNA interference). Demostraron que los RNA bicatenarios (dsRNA, double-stranded RNAs) eran captados por las células, donde inducían una respuesta que llevaba a la destrucción selectiva de los mRNA con la misma secuencia que los dsRNA agregados. Supóngase por ejemplo que se desea detener la producción de la enzima fosforilasa de glucógeno dentro de las células de un nematodo, de modo que sea posible determinar el efecto de esta deficiencia enzimática en el fenotipo del gusano. De manera notable, este resultado puede obtenerse con sólo colocar al gusano en una solución de dsRNA que tenga la misma secuencia que el mRNA en cuestión. Un experimento similar se muestra en la figura 11.36b,c. Este fenómeno tiene efectos muy similares a los de la formación de ratones con genes inactivados, aunque los mecanismos son muy diferentes.

La interferencia del RNA mediada por dsRNA es un ejemplo de desactivación del RNA, un fenómeno amplio en el que RNA pequeños (trabajando casi siempre en conjunto con una maquinaria proteínica) inhiben de varias maneras la expresión génica. Se cree que la RNAi evolucionó como un tipo de “sistema inmunitario genético”, para proteger a los organismos de la presencia de material genético extraño o indeseable. En términos más específicos, es probable que la RNAi haya evolucionado como mecanismo para bloquear la replicación de los virus y/o suprimir el movimiento de los transposones dentro del genoma, puesto que estos dos procesos potencialmente peligrosos pueden incluir la formación de RNA bicatenario. Las células pueden reconocer los dsRNA como “indeseables”, porque estas moléculas no se producen mediante las actividades genéticas normales de la célula.

La figura 11.37a muestra los pasos implicados en la vía de la RNAi. El RNA bicatenario que inicia la respuesta primero se divide en pequeños fragmentos (de 21 a 23 nucleótidos), llamados RNA interferentes pequeños (siRNA, small interfering RNAs), por la acción de un tipo particular de ribonucleasa llamada Dicer. Las enzimas de la clase a la que pertenece Dicer actúan de manera específica en sustratos de dsRNA y generan pequeños fragmentos bicatenarios con segmentos sobresalientes 3′, como se muestra en la figura 11.37a. Después, estos pequeños dsRNA se incorporan a un complejo (identificado como pre-RISC en la figura 11.37a) que contiene un miembro de la familia Argonauta de proteínas. Los integrantes de dicha familia tienen una función clave en todas las vías de desactivación del RNA. En la vía de RNAi, una de las hebras del dúplex de RNA (llamada cadena pasajero) se divide en dos y luego se disocia del pre-RISC. La otra hebra (llamada cadena guía) se incorpora, junto con su pareja Argonauta, en un complejo proteínico relacionado llamado RISC. Se han identificado algunas variedades diferentes de dichos complejos, las cuales se distinguen por la proteína Argonauta particular que contienen. En las células animales, los RISC que contienen siRNA casi siempre incluyen la proteína Argonauta Ago2. El RISC aporta la maquinaria para que el diminuto siRNA de cadena sencilla se adhiera a un RNA que tenga la secuencia complementaria. Una vez unido, el RNA en cuestión se divide en un sitio específico por la acción de ribonucleasa de la proteína Ago2. Por lo tanto, el siRNA actúa como guía para dirigir al complejo hacia el RNA complementario, que posteriormente es destruido por una proteína adjunta. Cada siRNA puede orquestar la destrucción de muchas copias del RNA diana, el cual puede ser un transcrito vírico, un RNA transcrito de un transposón o un retrotransposón o un mRNA del hospedador seleccionado para su estudio, como se describe al principio de esta sección.

La interferencia del ácido ribonucleico se ha estudiado mucho en plantas y en nematodos. De hecho, en general se acepta que los vertebrados no utilizan RNAi como defensa contra virus, sino que dependen de un sistema inmunitario bien desarrollado.⁵ En realidad, cuando se agrega un dsRNA a células de mamífero que crecen en cultivo o se inyecta al cuerpo de un mamífero, en lugar de detener la traducción de una proteína específica, casi siempre se inicia una respuesta global que inhibe la síntesis de proteínas en general. Se cree que este paro general de la síntesis proteínica (que se explica en la sección 17.1) evolucionó como un medio para proteger a las células contra infecciones víricas. Para evitar esta respuesta total a gran escala, los investigadores optaron por el uso de dsRNA muy pequeños. Descubrieron que la introducción de dsRNA sintéticos de 21 nucleótidos de largo (tamaño equivalente al siRNA producido como intermediario durante la interferencia del RNA en otros organismos) a células de mamíferos no desencadena la inhibición global de la síntesis proteínica. Además, estos dsRNA fueron capaces de producir interferencia del RNA, o sea, bloquearon la síntesis de la proteína específica codificada por un mRNA que tenía una secuencia de nucleótidos concordante. Las proteínas codificadas por otros mRNA no se afectaron. Esta técnica se ha convertido en una estrategia experimental importante para aprender más sobre la función de genes específicos. Es posible sólo eliminar la actividad de un gen determinado con el uso de dsRNA para destruir los mRNA transcritos y buscar cualquier alteración celular que se produzca por la deficiencia de la proteína codificada (figs. 8.8 y 18.51). Se han formado bibliotecas con miles de siRNA para su uso en experimentos encaminados a determinar las actividades de muchos genes en un solo estudio. La importancia clínica potencial de la RNAi se analiza en la sección “Perspectiva humana” de este capítulo.

MicroRNA: pequeños RNA que regulan la expresión génica

En 1993 se sabía que los embriones de C. elegans que carecían del gen lin-4 eran incapaces de convertirse en larvas normales en etapa avanzada. En ese año Victor Ambros, Gary Ruvkun y col., de la Harvard University, informaron que el gen lin-4 codifica un RNA pequeño que es complementario de algunos segmentos en la región 3′ no traducida de un mRNA específico que codifica la proteína LIN-14. Propusieron que, durante el desarrollo larvario, el RNA lin-4 se une al mRNA complementario y bloquea la traducción del mensaje, lo cual activa una transición a la siguiente etapa del desarrollo. Los mutantes incapaces de producir el pequeño RNA lin-4 poseen una concentración excesiva de la proteína LIN-14 y no pueden experimentar de manera normal la transición a etapas larvarias posteriores. Éste fue el primer ejemplo claro de desactivación de RNA en la expresión génica, pero pasaron varios años antes de que se valorara la importancia de tales descubrimientos. En el año 2000 se encontró que uno de estos RNA pequeños del gusano (una especie de 21 nucleótidos llamada let-7) se ha conservado en gran medida a través de la evolución. Por ejemplo, los seres humanos codifican varios RNA que son idénticos o muy parecidos a los let-7. Tal observación motivó un gran interés por estas moléculas.

En años recientes se evidenció que las plantas y los animales producen cientos de pequeños RNA llamados microRNA (miRNA) que, en virtud de su tamaño, habían pasado inadvertidos por muchas décadas. Como se descubrió primero en nematodos, miRNA específicos como lin-4 y let-7 se sintetizan sólo en ciertos periodos durante el desarrollo, o en algunos tejidos de una planta o un animal, y se piensa que tienen una función reguladora. En la figura 11.38 se muestra un ejemplo de expresión selectiva de miRNA específicos durante el desarrollo del pez cebra.

La dimensión de los miRNA, que oscila entre 21 y 24 nucleótidos de longitud, los coloca en el mismo intervalo de tamaño de los siRNA implicados en la RNAi. Esta observación es más que una coincidencia, puesto que los miRNA se producen por una maquinaria de procesamiento similar a la encargada de formar los siRNA. Los miRNA y siRNA podrían considerarse “primos”, dado que ambos actúan en vías de desactivación del RNA posterior a la transcripción. Sin embargo, hay diferencias importantes. Un siRNA proviene del producto bicatenario de un virus o de un elemento transponible (o de un dsRNA aportado por el investigador) y se dirige a los mismos transcritos de los que se originó. En cambio, un miRNA es codificado por un segmento convencional del genoma y se dirige a un mRNA específico como parte de un programa celular normal. En otras palabras, los siRNA sirven sobre todo para mantener la integridad del genoma, mientras que los miRNA sirven en primera instancia para regular la expresión génica.

En la figura 11.37b se muestra la vía para la síntesis de un miRNA típico. Éste se sintetiza por la acción de la RNA polimerasa II como un transcrito primario con un casquete 5′ y una cola de poli(A). Este transcrito primario se pliega sobre sí mismo para formar un largo RNA bicatenario con forma de horquilla llamado pri-miRNA. Éste se secciona dentro del núcleo por la acción de una enzima llamada Drosha, lo que forma un precursor bicatenario más corto en forma de horquilla (o pre-miRNA), como se muestra en el paso 1 de la figura 11.38b. El pre-miRNA se exporta al citoplasma, donde da origen al pequeño miRNA bicatenario. El miRNA se genera a partir de un pre-miRNA por efecto de la enzima Dicer, la misma ribonucleasa que forma los siRNA. Como ocurre con éstos, el miRNA bicatenario se relaciona con una proteína Argonauta en cuya compañía se desensambla el dúplex de RNA y una de las cadenas individuales se incorpora en un complejo RISC, como se muestra en la figura 11.37b.

Un miRNA típico es parcialmente complementario de una parte de la región no traducida 3′ (3′ UTR, 3′ untranslated region) de su mRNA diana (como en la figura 11.37b). En estos casos, el apareamiento de bases implica seis o siete nucleótidos cerca del extremo 5′ del miRNA (casi siempre las bases 2-8), que en conjunto se conocen como región “semilla”, además de algunos pares de bases adicionales en otro punto del miRNA. El miRNA del complejo RISC guía a la proteína Argonauta acompañante a un sitio muy cercano al mRNA unido. Como se expone en la sección 12.6, dicha proteína origina la desadenilación y la degradación del mRNA o reprime su traducción (consúltese la figura 12.63). Sin embargo, algunos miRNA (en particular los que se encuentran en las plantas) inducen la rotura de un enlace de fosfodiéster específico localizado dentro del esqueleto del mRNA. Al igual que ocurre con los siRNA que aparecen en la figura 11.37a, la división del mRNA es catalizada por una actividad “segmentadora” de la proteína Ago2 presente en el complejo RISC. Los microRNA que seccionan a los mRNA tienden a mostrar complementariedad total con su mRNA diana.

Se han identificado genes de microRNA en diversas formas: muy a menudo por el análisis computarizado de secuencias de DNA genómico, pero también por medio de aislamiento de mutantes o mediante secuenciación directa de pequeños RNA celulares. Estimaciones sugieren que los seres humanos podrían codificar más de 1 000 especies distintas de miRNA. Casi un tercio de los mRNA humanos contiene secuencias complementarias de miRNA probables, lo cual es un indicio sobre el grado en el que estos pequeños RNA reguladores podrían participar en el control de la expresión génica en organismos superiores. Un solo miRNA puede unirse a docenas, incluso a cientos, de mRNA distintos. Por el contrario, muchos mRNA contienen secuencias complementarias para varios miRNA diferentes, lo que sugiere que éstos pueden actuar en varias combinaciones para “ajustar con precisión” el nivel de expresión génica. Esta predicción se respalda con experimentos en los que se obliga a las células a captar y expresar genes de miRNA específicos. En estas condiciones se afecta a muchos mRNA de las células modificadas por ingeniería genética. Cuando se introducen genes de miRNA diferentes en estas células, disminuye la expresión de distintos grupos de mRNA, lo que indica que el efecto responde a secuencias específicas. Este tipo de ajuste preciso difiere en gran medida según los efectos mucho más drásticos de ciertos miRNA; un ejemplo es lin-4, que disminuye la expresión de un mRNA hasta el punto que activa un cambio mayor en el transcurso del desarrollo (pág. 459).

Los microRNA se han implicado en muchos procesos, como la generación de un patrón para el sistema nervioso central, el control de la proliferación y la muerte celulares, el desarrollo de hojas y flores en las plantas y la diferenciación de varios tipos de células (sección 12.6). Las funciones de los miRNA en el desarrollo de cáncer se exploran al final de la sección 16.3. La separación de las funciones de miRNA individuales durante el desarrollo de los mamíferos y la homeostasis de los tejidos promete ser un tema de investigación en el próximo decenio.

piRNA: una clase de pequeños RNA que funcionan en las células germinales

En el capítulo 10 se explicó que el movimiento de los elementos transponibles representa una amenaza para el genoma, debido a que éstos pueden interrumpir la actividad de los genes al insertarse en ellos. Si este tipo de salto genómico ocurriera durante la vida de una célula hepática o renal adulta, es probable que las consecuencias fueran mínimas, puesto que el fenómeno de transposición afecta sólo a esa célula particular y a su descendencia (si la célula somática todavía es capaz de dividirse). Sin embargo, si el fenómeno de transposición ocurre en una célula germinal, o sea, una célula con la capacidad para generar gametos, puede afectar a todas las células de un individuo de la siguiente generación. Por lo tanto, no es sorprendente que se hayan desarrollado mecanismos especializados para suprimir el movimiento de elementos transponibles en las células germinales.

En la página 457 se señaló que una de las funciones aparentes de los siRNA es prevenir el movimiento de elementos transponibles. Estudios recientes indican que las células germinales de los animales expresan una clase distinta de RNA pequeños llamados RNA asociados a piwi (piRNA, piwi-interactive RNAs) que suprimen el movimiento de elementos transponibles en la línea germinal. Los piRNA obtienen su nombre de las proteínas con las que se relacionan. Estas moléculas se llaman PIWI y son una subclase de la familia Argonauta, la misma que se relaciona con los siRNA y los miRNA como parte de sus complejos RISC. Las funciones de las proteínas PIWI se han estudiado mejor en la mosca de la fruta, en la que la deleción de estas moléculas causa defectos en la supresión del movimiento de transposones en las células germinales y, al final, conduce a la falla en la formación de gametos. Los piRNA junto con sus proteínas PIWI relacionadas también son necesarios para la formación exitosa de gametos en ratones machos, aunque no en hembras (en las que la protección contra elementos transponibles puede ocurrir gracias a endo-siRNA, cuyas características se exponen en el pie de la página 457).

Existen varias diferencias importantes entre los piRNA y los si/miRNA: (1) los primeros (que miden de 24 a 32 nucleótidos) son más largos que los segundos; (2) la mayor parte de los piRNA de los mamíferos puede rastrearse hasta un pequeño número de loci genómicos enormes, algunos de los cuales codifican miles de piRNA diferentes; (3) los piRNA pueden experimentar un proceso de amplificación que genera copias adicionales, y (4) la formación de piRNA no involucra la formación de precursores de dsRNA ni la división por efecto de la ribonucleasa Dicer. En cambio, parece que la biogénesis de piRNA depende de la actividad endonucleasa de la proteína PIWI que actúa en un largo transcrito primario de cadena sencilla. En las células, los piRNA que son activos contra elementos transponibles después se amplifican en un paso siguiente. Todavía se desconoce el mecanismo por el cual los piRNA actúan para desactivar la expresión del RNA.

Otros RNA no codificadores

Conforme ha madurado el campo de la biología celular y molecular, se ha aprendido poco a poco a apreciar la notable diversidad estructural y funcional de los RNA. En los decenios pasados se han descrito muchos tipos nuevos de estas moléculas, como se describe en las páginas previas. No obstante, los investigadores no estaban preparados para una ráfaga de hallazgos, los cuales indican que en condiciones normales se transcriben al menos dos tercios del genoma de un ratón o un humano, mucho más de lo que se esperaba con base en el número de secuencias “significativas” de DNA que se pensaba que existían. En realidad, la mayoría de las secuencias incluidas en este DNA transcrito se considera “basura”, incluidas grandes cantidades de elementos transponibles que constituyen una fracción considerable de los genomas de los mamíferos (pág. 411). Algunos estudios generan la interrogante de si existe alguna diferencia básica entre un gen y una región intergénica; en ellos se informa que la transcripción puede comenzar en sitios inesperados de todos los tipos en el genoma y que los transcritos se superponen mucho entre sí. Otros estudios revelan que las células a menudo transcriben ambas cadenas de un elemento de DNA, con lo que se produce un RNA codificante y un RNA no codificante. También se informa que pueden sintetizarse moléculas de RNA no codificante por acción de las polimerasas que al principio se habían unido con el promotor de un gen codificador de proteína y luego se movieron en dirección 5′ de ese sitio sobre la cadena opuesta del cromosoma, o sea, en sentido contrario al de las moléculas de polimerasa que transcriben el gen.

Tal como el DNA de una célula, o un organismo, constituye su genoma y las proteínas que sintetiza componen su proteoma, los RNA integran su transcriptoma. ¿Por qué el transcriptoma de un mamífero es tan grande? O en otras palabras, ¿por qué una célula transcribe todos estos tipos diversos de secuencias de DNA? No es posible responder esta pregunta básica. Según un punto de vista, gran parte de esta actividad de transcripción ubicua es sólo “ruido de fondo” que acompaña al complejo proceso de la expresión génica. Los que proponen esta perspectiva citan los resultados de estudios en ratones en los que se eliminaron bloques del genoma que carecían de genes codificadores de proteínas. En estos ensayos se observó que es posible el desarrollo de ratones sanos, aunque no puedan sintetizar los RNA no codificadores (ncRNA, noncoding RNAs) que se producirían en condiciones normales a partir de las secuencias de DNA eliminadas. Según un punto de vista opuesto, gran parte del RNA no codificador que se produce participa en actividades reguladoras diversas que aún no se identifican. Los que respaldan esta postura citan resultados que sugieren que dicha transcripción penetrante no es aleatoria; muchos de los transcritos no codificadores presentan patrones distintivos y reproducibles de distribución en tejidos específicos y su origen puede rastrearse hasta loci específicos en el genoma. Hay que tener presente que los siRNA, los miRNA y los piRNA sólo se conocen desde hace cerca de 10 años y es probable que falten por detectar otros tipos de ncRNA pequeños. No todos los transcritos no codificadores son diminutos. Se han identificado varios ncRNA conservados en la evolución, largos y que tienen más de 200 bases (como XIST, HOTAIR y AIRE), que actúan como reguladores de la estructura de la cromatina o de la transcripción génica, tal como se comenta en las secciones 12.2, 12.3 y 17.4, en dicho orden. Datos de algunos estudios sugieren que existen miles de ncRNA largos (lncRNA, long ncRNAs) conservados y de este modo, los pocos que han sido identificados representan una minúscula muestra del total. Incluso es posible que la mayor parte del producto de la transcripción del genoma de los mamíferos contenga la clave para explicar por qué los seres humanos tienen un número de genes parecido al de organismos considerados como mucho menos complejos (fig. 10.27). Sin importar la explicación real, hay un punto claro: todavía es mucho lo que se desconoce sobre las múltiples funciones de los RNA en las células eucariotas.

Una vez que la estructura del DNA se reveló en 1953, resultó evidente que la secuencia de nucleótidos de un gen especificaba el orden de los aminoácidos de un polipéptido. Parecía improbable que el DNA sirviera como un plantilla física directa para el ensamble de una proteína. De hecho, se asumió que la información almacenada en la secuencia nucleotídica estaba presente en algún tipo de código genético. Con el descubrimiento del mRNA como intermediario en el flujo de información del DNA a una proteína, la atención se enfocó en la manera en la cual una secuencia escrita en un “alfabeto” de ribonucleótidos podía codificar una secuencia en un “alfabeto” integrado por aminoácidos.

Propiedades del código genético

El físico George Gamow presentó uno de los primeros modelos del código genético, al proponer que tres nucleótidos secuenciales codificaban cada aminoácido en un polipéptido, es decir, las palabras del código, o codones, para los aminoácidos eran tripletes de nucleótidos. Gamow llegó a esta conclusión con un poco de lógica. Él razonó que al menos se requerían tres nucleótidos para cada codón individual. Considérese el número de palabras que puede articularse con un alfabeto que contiene cuatro letras correspondientes a las cuatro bases posibles que pueden estar presentes en un sitio en particular en el DNA (o mRNA). Hay cuatro palabras posibles formadas por una letra, 16 (4²) compuestas de dos letras y 64 (4³) de tres letras. Como existen 20 diferentes aminoácidos (palabras) que deben codificarse, los codones deben contener al menos tres nucleótidos sucesivos (letras). Francis Crick, Sydney Brenner y col., de la Cambridge University, verificaron con rapidez la naturaleza de los tripletes del código en diferentes experimentos genéticos.⁶

Además de proponer que el código estaba integrado por tripletes, Gamow sugirió que en él ocurría superposición. Aunque esta hipótesis era incorrecta, propició una importante pregunta concerniente al código genético. Considérese la siguiente secuencia de nucleótidos:

—AGCAUCGCAUCGA—

Si el código estuviera superpuesto, entonces el ribosoma se desplazaría a lo largo del mRNA un nucleótido a la vez, reconociendo un nuevo codón con cada movimiento. En la secuencia precedente, el triplete AGC debe codificar un aminoácido, GCA otro, CAU otro más y así sucesivamente. En cambio, si el código no estuviera superpuesto, cada nucleótido a lo largo del mRNA debería ser parte sólo de un codón. En la secuencia precedente, AGC, AUC y GCA especificarían aminoácidos sucesivos.

Una conclusión de la naturaleza superpuesta o no del código genético se infirió a partir de estudios de proteínas mutantes, como la hemoglobina modificada causante de la drepanocitosis. En esta patología, como en otros casos estudiados, se encontró que la proteína mutante contenía una sustitución de un solo aminoácido. Si el código estuviera superpuesto, un cambio de un par de bases en el DNA debería afectar a tres codones consecutivos (fig. 11.39) y, de esta forma, tres aminoácidos contiguos en el polipéptido correspondiente. Sin embargo, si el código no estuviera superpuesto y cada nucleótido formara parte sólo de un codón, sería de esperarse el reemplazo de un solo aminoácido. Éste y otros datos indicaron que el código no está superpuesto.

Debido a que un código basado en tripletes puede codificar 64 aminoácidos diferentes y a que en realidad existen sólo 20 aminoácidos para catalogar, surgió la pregunta sobre la función de los 44 tripletes adicionales. Si uno o todos los 44 tripletes restantes codifican aminoácidos, entonces al menos algunos de los aminoácidos son representados por uno o más codones. Un código de este tipo se dice que está degenerado. Como se descubrió, dicho sistema está muy degenerado, puesto que casi todos los codones posibles codifican aminoácidos. Los que no tienen una función especial de “puntuación” (tres de los 64), se reconocen por el ribosoma como codones de terminación y detienen la lectura del mensaje.

Francis Crick predijo primero la degeneración del código, en una teoría que consideraba el gran espectro de la composición de bases entre DNA de varias bacterias. Por ejemplo, se encontró que el contenido de G + C podía oscilar entre 20 y 74% del genoma, aunque la composición de aminoácidos de las proteínas de estos organismos mostraba poca variación. Esto sugirió que los mismos aminoácidos eran codificados por diferentes secuencias de bases, lo cual llevó a suponer que el código estaba degenerado.

Identificación de los codones

En 1961 ya se conocían las propiedades generales del código, pero aún no se descubría alguna codificación específica asignada a los tripletes. En ese momento, casi todos los genetistas pensaban que debían transcurrir cinco a 10 años antes de descifrar todo el código. Pero Marshall Nirenberg y Heinrich Matthaei desarrollaron una técnica que utilizaba una nucleótido fosforilasa para sintetizar sus propios mensajes genéticos artificiales y luego determinaron qué tipo de proteína codificaban. El primer mensaje sometido a prueba fue un polirribonucleótido compuesto sólo de uridina; el mensaje se denominó poly(U). Cuando éste se añadió a un tubo de ensayo que contenía un extracto bacteriano con los 20 aminoácidos y los materiales necesarios para las síntesis de proteínas (ribosomas y varios factores solubles), el sistema siguió las instrucciones del mensajero artificial y elaboró un polipéptido. Al analizarlo, se observó que era una polifenilalanina, un polímero de fenilalanina. Así, Nirenberg y Matthaei habían demostrado que el codón UUU codificaba a dicho aminoácido.

En los siguientes cuatro años, varios laboratorios se unieron en la búsqueda y se elaboraron mRNA sintéticos para descifrar los aminoácidos que eran codificados por los 64 codones posibles. El resultado fue la carta decodificadora universal para el código genético mostrada en la figura 11.40. El cuadro enlista la secuencia nucleotídica para cada uno de los 64 posibles codones en un mRNA. Las instrucciones para leerlo se encuentran en el pie de la figura.⁷

Las primeras excepciones para las asignaciones de los codones de la figura 11.40 se identificaron en mRNA mitocondriales. Por ejemplo, en las mitocondrias humanas, el triplete UGA indica la adición de un triptófano en vez de la terminación de la traducción, el codón AUA se lee como metionina en lugar de isoleucina y las secuencias AGA y AGG representan codones de detención en vez de indicar la inclusión de arginina en la cadena de aminoácidos. En fecha reciente se han hallado excepciones en los codones del DNA nuclear de protistas y hongos. Sin embargo, es evidente que estas desviaciones menores han evolucionado como cambios secundarios a partir del código genético estándar y que el sistema que aparece en la figura 11.40 se puede considerar como universal, es decir, que está presente en todos los organismos. Con base en lo anterior se puede concluir que todos los seres vivos conocidos que habitan el planeta en la actualidad comparten un origen evolutivo común.

El análisis del cuadro de codones de la figura 11.40 indica que la asignación de los aminoácidos no es aleatoria. Si se revisan las cajas de codones para un aminoácido específico, se advierte que éstas tienden a agruparse. La formación de grupos refleja la similitud en los codones que codifican al mismo aminoácido. Como resultado de esta similitud en las secuencias de los codones, mutaciones espontáneas que causan cambios de una sola base en un gen a menudo no alteran la secuencia de aminoácidos de la proteína correspondiente. Una mutación de la secuencia de nucleótidos que no afecta el orden de los aminoácidos se denomina sinónimo, mientras que un cambio que causa una sustitución de aminoácidos es no sinónimo. Las dos alteraciones mencionadas se muestran en la figura 11.41, que describe algunas de las variedades diferentes de mutaciones expuestas en este capítulo. Los cambios sinónimos (figura 11.41a) muestran una menor posibilidad de modificar el fenotipo de un organismo, en comparación con los no sinónimos (fig. 11.41b). En consecuencia, estos últimos cambios tienen una mayor posibilidad de ser seleccionados por parte de la selección natural para desaparecer o prevalecer. Ahora que se han secuenciado los genomas de organismos relacionados, como los chimpancés y los humanos, es posible observar de manera directa las secuencias de genes homólogos y ver cuántos cambios son sinónimos o no. Es posible que los genes que poseen un exceso de sustituciones no sinónimas en sus regiones codificadoras hayan sido influidos por selección natural (véase la nota al pie de la página 413).

El aspecto de “dispositivo de seguridad” del código va más allá de su degeneración. Las asignaciones de codones son tales que los aminoácidos similares tienden a ser especificados por codones semejantes. Por ejemplo, los codones de diferentes aminoácidos hidrófobos (mostrados en cuadros cafés en la figura 11.40) se agrupan en las primeras dos columnas del cuadro. Por consecuencia, una mutación que resulte en una sustitución de base en uno de estos codones sustituye casi siempre un residuo hidrofóbico por otro. Además, las semejanzas principales entre aminoácidos y codones relacionados aparecen en los primeros dos nucleótidos del triplete, en tanto que la mayor variabilidad ocurre en el tercer nucleótido. Por ejemplo, a la glicina la codifican cuatro codones, todos los cuales comienzan con los nucleótidos GG. Una explicación de este fenómeno se analiza en la siguiente sección, en la que se describe la función de los RNA de transferencia.

Los ácidos nucleicos y las proteínas son semejantes a dos lenguajes escritos con diferentes tipos de letra. Ésta es la razón por la cual la síntesis de proteínas se refiere como traducción. Este proceso requiere que la información en la secuencia nucleotídica de un mRNA se decodifique y utilice para dirigir el ensamble secuencial de aminoácidos en una cadena polipeptídica. Los RNA de transferencia (tRNA, transfer RNAs), que actúan como adaptadores, llevan a cabo la decodificación de la información de un mRNA. Cada tRNA se une a un aminoácido específico (como un aa-tRNA) y, por otro el lado, reconoce un codón en particular en el mRNA. La interacción entre codones sucesivos en el mRNA y aa-tRNA específicos lleva a la síntesis de un polipéptido con una secuencia ordenada de aminoácidos. Para entender cómo sucede esto, primero se debe considerar la estructura del tRNA.

Estructura de los tRNA

En 1965, luego de siete años de trabajo, Robert Holley, de la Cornell University, publicó la primera secuencia de bases de una molécula de ácido ribonucleico, la del tRNA de levadura que porta al aminoácido alanina (fig. 11.42a). Este tRNA se compone de 77 nucleótidos, 10 de los cuales son modificaciones de cuatro nucleótidos estándar de RNA (A, G, C, U), como lo indica la sección sombreada de la figura.

En los años siguientes se purificaron y secuenciaron otras especies de tRNA y se observaron similitudes entre ellos (fig. 11.42b). Todas estas moléculas constan del mismo número de nucleótidos, entre 73 y 93, y tienen un porcentaje significativo de bases raras que al parecer son resultado de modificaciones enzimáticas de alguna de las cuatro bases estándar, que ocurren después de incorporarse a la cadena de RNA de una manera postranscripcional. Además, todos los tRNA poseen secuencias de nucleótidos que son complementarias con secuencias localizadas en otras partes de la misma molécula. En consecuencia, todos los tRNA tienen la posibilidad de plegarse de manera parecida para formar una estructura que semeja a un trébol, donde el tallo es un segmento bicatenario y las hojas son asas de cadena simple (figs. 11.42 y 11.43). Las bases raras, que se encuentran en las asas, actúan para interrumpir la formación de puentes de hidrógeno y también sirven como sitios de reconocimiento para diferentes proteínas. Todos los tRNA maduros tienen el triplete CCA en su extremo 3′. Estos tres nucleótidos pueden ser codificados por el gen de tRNA (en muchos procariotas) o agregarse de forma enzimática (en eucariotas). En el segundo caso, una enzima con una sola función agrega los tres nucleótidos en el orden apropiado sin necesidad de una plantilla de DNA o RNA.

Hasta este punto sólo se ha considerado la estructura secundaria o bidimensional de estas moléculas adaptadoras. Los RNA de transferencia pueden plegarse para formar una estructura terciaria única y definida. El análisis de difracción de rayos X muestra que estas moléculas se integran con dos hélices dobles dispuestas en forma de L (fig. 11.43b). Las bases que se observan en sitios comparables en todas las moléculas de tRNA (las bases invariables de la figura 11.42b) tienen importancia particular para formar la estructura terciaria común en forma de L. La morfología común de los tRNA refleja el hecho de que todos deben tomar parte en la misma serie de reacciones durante la síntesis de proteínas. Sin embargo, cada tRNA posee características únicas que lo distinguen de los demás. Como se menciona en la siguiente sección, son estas propiedades las que hacen posible que un aminoácido se fije de manera enzimática al tRNA apropiado (cognado).

Los RNA de transferencia traducen una secuencia de codones, localizados en un mRNA, en una cadena de aminoácidos. La información contenida en el mRNA se decodifica a través de la formación de pares de bases entre secuencias complementarias localizadas en los RNA de transferencia y el mensajero (fig. 11.49). Así, como en otros procesos en los que intervienen ácidos nucleicos, la complementariedad entre pares de bases es el fundamento del proceso de traducción. La parte del tRNA que participa en esta interacción específica con el codón del mRNA es un tramo de tres nucleótidos secuenciales denominado anticodón, que se localiza en el asa media de la molécula (fig. 11.43a). Dicha región se compone de manera invariable de siete nucleótidos, de los cuales los tres mediales forman un anticodón. Éste se sitúa en un extremo de la molécula de tRNA en forma de L, opuesto al sitio al cual se une el aminoácido (fig. 11.43b).

Dado que son 61 codones diferentes los que pueden especificar a un aminoácido, sería de esperarse que una célula tuviera cuando menos 61 distintos tRNA, cada uno con un anticodón diferente complementario de uno de los codones de la figura 11.40. Pero hay que recordar que las similitudes más notorias entre los codones que codifican el mismo aminoácido ocurren en los primeros dos nucleótidos del triplete, en tanto que la mayor variabilidad de estos mismos se observa en el tercer nucleótido. Considérense los 16 codones que terminan en U. En cada caso, si la U cambia a C, se codifica el mismo aminoácido (primeras dos líneas de cada cuadro en la figura 11.40). De manera similar, en la mayor parte de los casos, un cambio entre una A y una G en el tercer sitio tampoco tiene efecto en la determinación del aminoácido. La posibilidad de intercambiar la tercera base llevó a Francis Crick a proponer que el mismo RNA de transferencia podía reconocer a más de un codón. Su propuesta, llamada hipótesis del bamboleo, sugería que el requerimiento estérico entre el anticodón del tRNA y el codón del mRNA podía ser muy estricto para los primeros dos sitios y quizá más flexible en la tercera posición; esto permitía a dos codones que codifican el mismo aminoácido, y que sólo difieren en la tercera posición, emplear el mismo tRNA en la síntesis de proteínas. Una vez más, la hipótesis de Crick resultó correcta.

Las reglas que gobiernan la inestabilidad en la tercera posición del codón son las siguientes (fig. 11.44): la U del anticodón puede formar pares con la A o la G del mRNA; la G del anticodón puede unirse a la U o a la C del RNA mensajero; y la I (inosina, derivada de la guanina en la molécula del tRNA original) del anticodón puede aparearse con el U, la C o la A del mRNA. Como resultado del bamboleo, los seis codones para leucina, por ejemplo, sólo requieren tres tRNA.

Activación de los aminoácidos

Durante la síntesis de polipéptidos es muy importante que cada molécula de RNA de transferencia se una al aminoácido correcto (cognado). Los aminoácidos se unen mediante enlaces covalentes a los extremos 3′ de sus tRNA cognados por acción de una enzima llamada aminoacil tRNA sintetasa (aaRS; aminoacyl-tRNA synthetase) (fig. 11.45). Aunque existen muchas excepciones, los organismos por lo general contienen 20 aminoacil-tRNA sintetasas, una para cada uno de los 20 aminoácidos que se incorporan a las proteínas. Cada una de estas enzimas es capaz de “cargar” todos los tRNA apropiados para ese aminoácido (es decir, cualquier tRNA cuyos anticodones reconozcan los diferentes codones específicos para ese aminoácido, como se indica en la fig. 11.40). Las aminoacil-tRNA sintetasas son un excelente ejemplo de la especificidad de las interacciones entre las proteínas y los ácidos nucleicos. Deben existir ciertas características comunes entre todas las especies de tRNA que codifican a un aminoácido determinado para permitir a una aminoacil tRNA sintetasa reconocerlas a todas ellas y al mismo tiempo discriminar a todos los tRNA de otros aminoácidos. La información relacionada con las propiedades estructurales de los tRNA, gracias a la cual éstos pueden seleccionarse o rechazarse como sustratos, proviene de manera primaria de las siguientes dos fuentes:

1. Determinación de la estructura tridimensional de estas enzimas por medio de cristalografía por rayos X, lo que posibilita a los investigadores la identificación de los sitios en el tRNA que hacen contacto directo con la proteína. Como lo ilustra la figura 11.45, los dos extremos del tRNA (el brazo aceptor y el anticodón), son importantes para el reconocimiento de la mayor parte de estas enzimas.

2. La determinación de los cambios en un tRNA que causan que la molécula sea aminoacilada por una sintetasa no cognada. Por ejemplo, se ha encontrado que un par de bases específico en el tRNA^Ala (el par de bases G-U que incluye a la tercera G del extremo 5′ de la molécula que aparece en la figura 11.42a) es el que determina, en primera instancia, su interacción con la alanil tRNA sintetasa. La inserción de este par de bases específico en el tallo aceptor de un tRNA^Phe o un tRNA^Cys es suficiente para hacer que dicha enzima reconozca a estos tRNA y se aminoacilen con alanina.

Las aminoacil-tRNA sintetasas llevan a cabo la siguiente reacción de dos pasos:

En el primer paso, la energía del ATP activa al aminoácido por la formación de un aminoácido adenilado, el cual se une a la enzima. Este es el paso primario (que requiere energía) de la reacción química que lleva a la síntesis del polipéptido. Los acontecimientos subsecuentes, como la transferencia del aminoácido a la molécula de tRNA (paso 2 de las reacciones anteriores) y después al polipéptido, son favorables desde el punto de vista termodinámico. El PP_i producido en la primera reacción se hidroliza a continuación para formar P_i, lo que fuerza aún más la reacción total hacia la formación de productos (pág. 431). Como se observa más adelante, durante la síntesis de proteínas se gasta energía, pero no se utiliza en la formación de enlaces peptídicos. En el segundo paso, la enzima transfiere su aminoácido al extremo 3′ de un tRNA cognado.

Entre los 20 aminoácidos que se incorporan a las proteínas, algunos tienen una estructura muy parecida entre sí. Las sintetasas que catalizan las reacciones en las que participan dichos aminoácidos “de aspecto similar”, en forma típica cuentan con un segundo sitio de edición además de la región catalítica. En caso de que la sintetasa colocara un aminoácido inapropiado en un sitio catalítico del tRNA, se activaría un mecanismo corrector de la enzima que rompe el enlace entre el aminoácido y el tRNA en el sitio de edición.

Se han desarrollado varios métodos que permiten a los investigadores sintetizar proteínas, en un tubo de ensayo o dentro de las células, que contienen aminoácidos no naturales, o sea, aminoácidos distintos a los 20 que se incorporan con la maquinaria de traducción. Éstos no se generan por modificación de los aminoácidos normales después de su incorporación al polipéptido, sino que se codifican de manera directa dentro del mRNA. Esta “expansión” del código genético casi siempre implica el uso de un tRNA modificado en forma experimental que reconoce uno de los codones de detención y una aminoacil tRNA sintetasa cognada que identifica de manera específica al aminoácido no natural. Después, éste se incorpora a la cadena polipeptídica dondequiera que se encuentre un codón de detención particular en un mRNA. Con estos métodos, los investigadores pueden sintetizar una proteína que contenga grupos químicos capaces de informar las actividades de ésta, o pueden diseñar proteínas con estructuras nuevas para usarlas como fármacos potenciales o en otras aplicaciones comerciales.

La síntesis de proteínas, o traducción, quizá sea la actividad sintética más compleja en una célula. El ensamblaje de una proteína requiere todos los diferentes tRNA con sus aminoácidos unidos, ribosomas, un mRNA, algunas proteínas con funciones distintas, cationes y GTP (trifosfato de guanosina). La complejidad no es sorprendente si se considera que la síntesis de proteínas necesita la incorporación de 20 aminoácidos diferentes en el orden preciso según un mensaje codificado en un lenguaje que emplea diversos elementos. En la descripción siguiente se analizan sobre todo los mecanismos de traducción que operan en las células bacterianas, que son más simples y mejor conocidos. El proceso es muy similar en las células eucariotas.

La síntesis de una cadena polipeptídica puede dividirse en tres actividades muy diferentes: iniciación, elongación, y terminación de la cadena. A continuación se describe cada una de estas actividades.

Iniciación

Una vez que se une a un mRNA, el ribosoma siempre se mueve a lo largo de él pasando de un codón al próximo, es decir, en bloques consecutivos de tres nucleótidos. Para asegurar que se lean los tripletes apropiados, el ribosoma se une al mRNA en un sitio preciso denominado codón de iniciación, el cual corresponde al triplete AUG. La unión a este codón pone al ribosoma de manera automática en el marco de lectura apropiado, de tal modo que el ribosoma lee el mensaje entero de manera correcta, desde este punto de inicio. Por ejemplo, en el caso siguiente:

—CUAGUUACAUGCUCCAGUCCGU—

el ribosoma se mueve del codón de inicio, AUG, a los próximos tres nucleótidos, CUC, luego a CAG, y así de forma sucesiva a lo largo de toda la secuencia.

En la figura 11.46 se ilustran los pasos básicos del inicio de la traducción en las células bacterianas.

Paso 1: traslado de la subunidad ribosómica pequeña al codón de iniciación

Como se advierte en la figura 11.46, un mRNA no se une a un ribosoma intacto, sino a las subunidades pequeña y grande en estadios separados. El primer paso relevante de la iniciación es la unión de la subunidad ribosómica pequeña a la primera secuencia AUG (o una de las iniciales) del mensaje, que sirve como el codón de iniciación.⁸ ¿De qué manera la subunidad pequeña selecciona el codón inicial AUG en vez de alguno interno? Los mRNA bacterianos poseen una secuencia específica de nucleótidos (de Shine-Dalgarno, nombrada así por sus descubridores) que se localiza 5 a 10 nucleótidos antes del codón de iniciación. La secuencia Shine-Dalgarno es complementaria de una secuencia de nucleótidos próxima al extremo 3′ del RNA ribosómico 16S de la subunidad ribosómica pequeña.

La interacción entre estas secuencias complementarias en el mRNA y el rRNA coloca la subunidad 30S en el codón de iniciación AUG.

La iniciación requiere factores de inicio Varios de los pasos que se describen en la figura 11.46 necesitan la ayuda de proteínas solubles, denominadas factores de iniciación (designados como IF en procariotas y eIF en eucariotas). Las células bacterianas necesitan tres de estos factores (IF1, IF2 e IF3), los cuales se unen a la subunidad 30S (paso 1 de la fig. 11.46). El IF2 es una proteína que se une al GTP requerido para la unión del primer aminoacil-tRNA. El IF3 puede prevenir que la subunidad grande (50S) se una en forma prematura a la subunidad pequeña 30S y también facilita la entrada del aa-tRNA iniciador apropiado. El IF1 facilita la unión de la subunidad 30S al mRNA y puede prevenir que el aa-tRNA entre a un sitio erróneo en el ribosoma.

Paso 2: traslado del primer aa-tRNA al ribosoma

Si se examinan las asignaciones de los codones (fig. 11.40), se puede observar que el triplete AUG no representa tan sólo la iniciación, sino que es el único que codifica a la metionina. En realidad, dicho residuo siempre es el primer aminoácido que se incorpora en el extremo terminal-N de un polipéptido naciente (en procariotas, la metionina inicial porta un grupo formilo, que la convierte en N-formilmetionina). Luego, la metionina (o N-formilmetionina) se elimina por medios enzimáticos de la mayoría de las proteínas recién sintetizadas. Las células poseen dos metionil-tRNA: uno se utiliza en el inicio de la síntesis proteínica y otro diferente incorpora residuos de metionilo en el interior del polipéptido. Gracias al IF2, el aa-tRNA iniciador entra en el sitio P del ribosoma (paso 2 de la fig. 11.46), donde se une al codón AUG del mRNA y los factores IF1 e IF3 se liberan.

Paso 3: ensamblaje del complejo de iniciación completo

Una vez que el tRNA iniciador se une al codón AUG y el IF3 se desplaza, la subunidad grande se adhiere al complejo y el GTP incorporado al IF2 se hidroliza (paso 3 de la fig. 11.46). Es probable que la hidrólisis de GTP genere un cambio conformacional en el ribosoma, necesario para la liberación del IF2 unido a GDP.

Inicio de la traducción en eucariotas

Los ribosomas eucariotas contienen rRNA de mayor tamaño y proteínas adicionales, mientras que los mRNA poseen características especializadas como casquetes 5′ y colas de poli(A). No es sorprendente que el inicio de la traducción en los organismos eucariotas sea totalmente diferente y más complejo que en las bacterias y, además, que constituya una fase importante en la cual se ejerce control sobre la expresión génica (véase la sección 12.6). Las células con organelos membranosos necesitan por lo menos 12 factores de iniciación que incluyen un total de más de 25 cadenas polipeptídicas. Como se indica en la figura 11.47, varios de estos eIF (p. ej., eIF1, eIF1A y eIF3) se unen a la subunidad 40S, lo cual la alista para su unión con el mRNA. El tRNA iniciador ligado a una metionina también se une a una subunidad 40S antes de su interacción con el mRNA y después entra en el sitio P de la subunidad en asociación con el complejo eIF2-GTP. Una vez que estos sucesos se llevan a cabo, la subunidad ribosómica pequeña con sus factores de iniciación relacionados y el tRNA cargado (que juntos integran un complejo de preiniciación 43S) está lista para encontrar el extremo 5′ del mRNA, que tiene el casquete de metilguanosina (pág. 448).

Al principio, el complejo 43S se desplaza hacia el mRNA con la ayuda de un grupo de factores de iniciación que ya se encuentran unidos al mRNA (fig. 11.47). De estos factores: (1) el eIF4E se une al casquete 5′ del mRNA de eucariotas; (2) el eIF4A se moviliza a lo largo del extremo 5′ del mensaje y remueve cualquier región de doble cadena que podría interferir con el movimiento del complejo 43S a lo largo del mRNA, y (3) el eIF4G sirve como un puente entre el extremo 5′ con el casquete y la cola de poli(A) del mRNA (fig. 11.47). De esta forma, el eIF4G convierte un mRNA lineal en un mensaje circular.

Una vez que el complejo 43S se une al extremo 5′ del mRNA, recorre el mensaje hasta reconocer una secuencia nucleotídica (por lo general el 5′—CCACCAUGC—3′) que contenga el codón de iniciación AUG. Cuando esto ocurre, se hidroliza el GTP unido al eIF2 y la subunidad grande (60S) se une al complejo. La formación del ribosoma 80S completo necesita de la actividad de otra proteína ligadora de GTP llamada eIF5B-GTP, cuyo enlace con GTP también es hidrolizado. La rotura de los dos GTP unidos y la formación del ribosoma completo se acompañan de la liberación de todos los factores de iniciación. Los fenómenos en cuestión dejan al anticodón de tRNA iniciador unido al codón de comienzo AUG en el sitio P del ribosoma ensamblado. En este momento, el complejo está listo para la primera fase de la elongación.^9,10

Función de los ribosomas

Tras alcanzar el punto en el cual se ha ensamblado por completo un ribosoma, es posible ver de manera más detallada la estructura y la función de esta estructura de múltiples subunidades. Los ribosomas son máquinas moleculares, similares en algunos aspectos a los motores descritos en el capítulo 9. Durante la traducción, un ribosoma experimenta un ciclo repetitivo de cambios mecánicos impulsado por la energía liberada por la hidrólisis de GTP. A diferencia de la miosina o la cinesina, las cuales de forma simple se mueven a lo largo de una estructura física, los ribosomas se desplazan sobre una “cinta” de mRNA (que contiene la información codificada). En otras palabras, los ribosomas son máquinas programables: la información almacenada en los mRNA determina la secuencia de los aminoacil-tRNA que el ribosoma acepta durante la traducción. Otra característica que distingue a los ribosomas de muchas otras máquinas celulares es la importancia de los RNA que lo componen. Los RNA ribosómicos ejercen funciones esenciales en la selección de los tRNA y aseguran una traducción precisa al unir factores proteínicos y polimerizar aminoácidos (este aspecto se revisa en la sección “Vías experimentales” al final del capítulo).

En los últimos años avanzó en gran medida la comprensión de la estructura de los ribosomas bacterianos. Los estudios iniciales que emplearon microscopia crioelectrónica de alta resolución (sección 18.8) revelaron que el ribosoma tenía una estructura muy irregular con lóbulos, protuberancias, conductos y puentes (fig. 2.56). Estos ensayos también proporcionaron información sobre los principales cambios conformacionales que ocurren en las subunidades pequeña y grande durante la traducción. Durante la década de 1990 se hicieron grandes avances en la cristalización de los ribosomas y para el final de esa década aparecieron los primeros informes sobre la estructura de los ribosomas de procariotas obtenida por cristalografía por rayos X. La figura 11.48a,b muestra la estructura general de las dos subunidades de un ribosoma bacteriano, tal como lo revela la cristalografía por rayos X. En fecha reciente esta técnica se ha utilizado con éxito en el estudio de ribosomas eucariotas de mayor tamaño, que comparten con sus equivalentes procariotas las mismas estructuras centrales y funciones primarias.

Cada ribosoma tiene tres regiones para la vinculación de moléculas de RNA de transferencia. Estas áreas, denominadas sitio A (aminoacilo), sitio P (peptidilo) y sitio E (de salida), reciben cada tRNA en pasos sucesivos del ciclo de elongación, como se describe en la siguiente sección. Las posiciones de los tRNA unidos a los sitios A, P y E de las subunidades pequeña y grande de los ribosomas se muestran en la figura 11.48a,b. Los tRNA se unen dentro de estas regiones y abarcan el espacio que hay entre las dos unidades ribosómicas (fig. 11.48c). Los extremos de los anticodones de los tRNA unidos hacen contacto con la subunidad pequeña, la cual tiene una función importante al decodificar la información contenida en el mRNA. En cambio, los extremos que unen a los aminoácidos del tRNA contactan a la subunidad grande, que posee una función relevante al catalizar la formación de los enlaces peptídicos. Otras características importantes que han sido reveladas por estos análisis estructurales de alta resolución incluyen lo siguiente:

1. La interfase entre las subunidades grande y pequeña forma una cavidad relativamente espaciosa (fig. 11.48c) ocupada casi de modo exclusivo por RNA. La porción de la subunidad pequeña que limita a esta cavidad está delineada por una hélice continua de RNA bicatenario. Ésta aparece sombreada en la estructura bidimensional del rRNA16S en la figura 11.3. Las superficies de las dos subunidades que se enfrentan la una a la otra contienen los sitios de unión para el mRNA y los tRNA entrantes y, por lo tanto, son esenciales para la función del ribosoma. El hecho de que estas superficies se integren en su mayor parte con RNA apoya la propuesta de que los ribosomas primigenios estaban formados casi de manera exclusiva por ácido ribonucleico (pág. 454).

2. El sitio activo, donde se unen de modo covalente los aminoácidos, también está formado por RNA. Esta porción catalítica de la subunidad grande reside en una cavidad profunda, la cual impide que el enlace peptídico recién formado sea hidrolizado por el solvente acuoso.

3. El mRNA se halla en un conducto estrecho que rodea el cuello de la subunidad pequeña y pasa a través de los sitios A, P y E. Antes de entrar al sitio A, el mRNA se deshace de cualquier estructura secundaria que pudiera ostentar mediante la actividad helicasa del ribosoma.

4. Un túnel se proyecta a través del núcleo de la subunidad grande desde el sitio activo. Dicho corredor provee una vía para la translocación del polipéptido creciente a través del ribosoma (fig. 11.48c).

5. La mayor parte de las proteínas de las subunidades ribosómicas tiene múltiples sitios de unión para RNA y se ubica en posiciones ideales para estabilizar la compleja estructura terciaria de los rRNA.

Elongación

Los pasos básicos del proceso de elongación de la traducción en células bacterianas se ilustran en la figura 11.49. Esta serie de pasos se repite una y otra vez conforme se polimerizan los aminoácidos en la cadena polipeptídica en crecimiento.

Paso 1: selección del aminoacil-tRNA

Con el tRNA iniciador cargado y en posición dentro del sitio P, el ribosoma queda disponible para la entrada de un segundo aminoacil-tRNA en el sitio A vacante, lo cual representa el primer paso de la elongación (paso 1, fig. 11.49a). Antes de que el segundo aminoacil-tRNA se una de manera eficiente al mRNA expuesto en el sitio A, debe combinarse con un factor de elongación de proteína unido a GTP, que se conoce como EF-Tu (o Tu) en procariotas y eEF1A en eucariotas. El EF-Tu es necesario para introducir los aminoacil-tRNA en el sitio A del ribosoma. Aunque cualquier complejo aminoacil-tRNA—Tu-GTP puede ingresar al sitio, sólo el que tiene el anticodón complementario del codón del mRNA alojado en el sitio A activará los cambios conformacionales necesarios dentro del ribosoma que hacen que el tRNA permanezca unido al mRNA en el centro de decodificación. Una vez que el aminoacil-tRNA—Tu-GTP correcto se une al codón del mRNA, el GTP se hidroliza y el complejo Tu-GDP se libera, dejando al aa-tRNA situado en el sitio A del ribosoma. La regeneración de Tu-GTP a partir del Tu-GDP liberado requiere otro factor de elongación llamado EF-Ts.

Paso 2: formación del enlace peptídico

Al final del primer paso, los dos aminoácidos (unidos a sus tRNA separados) yacen yuxtapuestos y alineados de manera precisa para poder reaccionar entre sí (fig. 11.48a′,b′). El segundo paso en el ciclo de elongación es la formación de un enlace peptídico entre estos dos aminoácidos (paso 2, fig. 11.49a), el cual se realiza cuando el nitrógeno del grupo amino del aa-tRNA en el sitio A reacciona con el carbono del grupo carbonilo del aminoácido unido al tRNA del sitio P, desplazándolo (fig. 11.49b). Como resultado de esta reacción, el tRNA unido al segundo codón en el sitio A tiene un dipéptido unido, mientras que el tRNA en el sitio P se desacila. La formación del enlace peptídico ocurre de manera espontánea sin la utilización de energía externa. La transferasa de peptidilo, un componente de la subunidad ribosómica grande, cataliza la reacción. Durante años se asumió que dicha enzima era una de las proteínas del ribosoma. Sin embargo, conforme resultó evidente la potencia catalítica del ácido ribonucleico, la atención se volvió al RNA ribosómico como posible catalizador para la formación de enlaces peptídicos. En la actualidad se ha demostrado que la actividad de transferasa de peptidilo reside en la molécula grande de RNA ribosómico de la subunidad 60S (véase la fotografía en la página inicial de este capítulo). En otras palabras, la transferasa de peptidilo es una ribozima, que se describe en la sección “Vías experimentales” al final del capítulo.

Paso 3: translocación

La formación del primer enlace peptídico deja un extremo de la molécula de tRNA del sitio A todavía fijado a su codón complementario sobre el mRNA y el otro lado de la molécula fijado a un dipéptido (paso 2 de la fig. 11.49a). El tRNA del sitio P queda entonces desprovisto de un aminoácido. La fase siguiente, llamada translocación, se caracteriza por un desplazamiento pequeño (6°) a manera de trinquete de la subunidad pequeña en relación con la subunidad grande, que se muestra en la figura 11.50a. En consecuencia, el ribosoma se desplaza un tramo de tres nucleótidos (un codón) a lo largo del mRNA en dirección 5′ → 3′ (paso 3 de la fig. 11.49a). La translocación se acompaña del movimiento (1) del dipeptidil-tRNA del sitio A al P del ribosoma y (2) del tRNA desacilado del sitio P al E. Conforme dichos desplazamientos ocurren, los dos tRNA mencionados permanecen unidos por enlaces de hidrógeno a sus codones en el mRNA. Mediante microscopia crioelectrónica se visualizó una etapa intermedia en dicho proceso, en el cual los tRNA ocupan “estados híbridos” de translocación parcial. En estas etapas, los extremos del anticodón del tRNA todavía están en los sitios A y P de la subunidad pequeña, mientras que los extremos aceptores de los tRNA ya se movieron a los sitios P y E de la subunidad grande. Se dice que los tRNA ocupan los sitios híbridos A/P y P/E, en dicho orden. En la figura 11.50b se señalan los pasos que ocurren durante el proceso de translocación. El cambio del estado “clásico” de movimiento continuo en el paso 1, figura 11.50b, al estado híbrido de desplazamiento interrumpido (paso 2) se produce de manera espontánea, es decir, sin que participen otros factores. Parecería que el ribosoma puede cambiar de un estado a otro sin estimulación. Una vez que cambió al estado híbrido, un factor de elongación unido a GTP (EF-G en bacterias y eEF2 en eucariotas) se une al ribosoma (paso 3) y lo estabiliza en el estado de desplazamiento interrumpido, impidiendo el movimiento retrógrado de los tRNA a la clásica conformación A/A y P/P. Después, la hidrólisis del GTP unido genera un cambio de conformación que mueve al mRNA y a los anticodones de los tRNA acompañantes en relación con la subunidad ribosómica pequeña, lo cual coloca a los tRNA unidos en los estados E/E y P/P, dejando al sitio A vacío (paso 4). Al mismo tiempo, el ribosoma regresa al estado de desplazamiento continuo. Después de esta reacción, el complejo EF-G-GDP se disocia del ribosoma (paso 5).

Paso 4: liberación del tRNA desacilado

En el paso final de la elongación (paso 4 de la fig. 11.49a), el tRNA desacilado sale del ribosoma y deja vacío el sitio E.

Por cada ciclo de elongación, al menos dos moléculas de GTP se hidrolizan: una durante la selección del aminoacil-tRNA y una durante la translocación. Cada ciclo de elongación toma casi un veinteavo de segundo, la mayor parte del cual transcurre buscando los aa-tRNA del citosol circundante. Una vez que el peptidil-tRNA se ha movido al sitio P por translocación, el sitio A está de nueva cuenta disponible para la entrada de otro aminoacil-tRNA, en este caso uno con un anticodón complementario del tercer codón (fig. 11.49a). Cuando el tercer tRNA cargado se vincula con el mRNA en el sitio A, el dipéptido del tRNA del sitio P se transfiere al aa-tRNA del sitio A y forma el segundo enlace peptídico y, en consecuencia, un tripéptido fijado al tRNA del sitio A. El tRNA del sitio P otra vez se encuentra desprovisto de un aminoácido. A la formación de enlaces peptídicos le siguen la translocación del ribosoma al cuarto codón y la expulsión del tRNA desacilado, después de lo cual el ciclo está listo para comenzar otra vez.

Se ha observado en esta sección de qué manera el ribosoma se mueve tres nucleótidos (un codón) a la vez a lo largo del mRNA. La secuencia particular de codones que utiliza un ribosoma (p. ej., el marco de lectura) se establece en el momento en que éste se une al codón de iniciación al comienzo de la traducción. Algunas de las mutaciones más nocivas son aquellas en las que un solo par de bases se agrega o se elimina del DNA. Se debe considerar el efecto de la adición o la deleción de uno o dos nucleótidos en una secuencia particular (fig. 11.41d). El ribosoma se mueve a lo largo del mRNA en un marco de lectura incorrecto desde la mutación. Las mutaciones de este tipo se conocen como mutaciones con cambio del marco de lectura. Tales mutaciones codifican una secuencia de aminoácidos anormal desde el punto donde ocurrió la mutación. Puede observarse que, después de más de dos décadas en las cuales se asumió que el ribosoma siempre se mueve de un triplete al próximo, se descubrieron varios ejemplos en los que los mRNA contenían una señal de recodificación que daba lugar a que el ribosoma cambiara su marco de lectura, retrocediendo (un desplazamiento al marco −1) o avanzando (un desfase al marco +1) un nucleótido.

Una gran cantidad de antibióticos ejerce su efecto al interferir con diferentes aspectos de la síntesis de proteínas en células bacterianas. Por ejemplo, la estreptomicina actúa por medio de la unión selectiva a la subunidad ribosómica pequeña de las bacterias y provoca que ciertos codones del mRNA se lean de manera errónea, de tal modo que se incrementa la síntesis de proteínas aberrantes. Debido a que el antibiótico no se une a los ribosomas eucariotas, carece de efecto en la traducción de los mRNA de las células del hospedador. La resistencia por parte de la bacteria a la estreptomicina puede estudiarse al observar los cambios de las proteínas ribosómicas, en particular de S12.

Terminación

Como se muestra en la figura 11.40, tres de los 64 codones funcionan como trinucleótidos de terminación que concluyen el ensamblaje del polipéptido en lugar de codificar un aminoácido. No existen tRNA cuyos anticodones sean complementarios de un codón de terminación.¹¹ Cuando el ribosoma alcanza uno de estos codones (UAA, UAG o UGA), se interrumpe la elongación y se libera al polipéptido relacionado con el último tRNA.

La terminación requiere de factores de liberación (RF, release factors), que pueden dividirse en dos grupos: los RF de clase I, que reconocen a los codones de detención en el sitio A del ribosoma, y los RF de clase II, que son proteínas de unión con GTP (proteínas G) cuyas funciones no se conocen del todo. Las bacterias tienen dos RF de clase I: el RF1, que reconoce a los codones de terminación UAA y UAG, y el RF2 que identifica a los codones de terminación UAA y UGA. Los organismos eucariotas tienen un solo RF de clase I, eRF1, que reconoce a los tres codones de detención. Los RF de clase I se integran al sitio A del ribosoma, como se muestra en la figura 11.51. Una vez dentro del sitio A, se cree que un tripéptido conservado en un extremo del factor de liberación interactúa con el codón de terminación en el sitio A e induce un cambio de conformación crucial que afecta a numerosos nucleótidos del mRNA de la subunidad ribosómica pequeña. Después, el enlace éster que vincula la cadena polipeptídica naciente con el tRNA se hidroliza y se libera el polipéptido completo. En este punto, la hidrólisis del GTP unido al RF de clase II (RF3 o eRF3) conduce a la liberación del RF de clase I del sitio A del ribosoma. Los pasos finales de la traducción incluyen la liberación del tRNA desacilado del sitio P, la disociación del mRNA del ribosoma y el desensamble del ribosoma en sus subunidades grande y pequeña para que éstas se utilicen en otra ronda de traducción. Estos procesos requieren varios factores proteínicos y son muy distintos entre los organismos eucariotas y las bacterias. En las últimas, tales proteínas incluyen a los factores EF-G, IF3 y RRF (ribosome recycling factor, factor reciclador de ribosomas), lo que fomenta la separación de las subunidades ribosómicas.

Vigilancia y control de calidad de los mRNA

Puesto que los tres codones de terminación pueden formarse por cambios de una sola base de muchos otros codones (fig. 11.40), es posible que ocurran mutaciones que produzcan codones de terminación dentro de la secuencia codificadora de un gen (fig. 11.41c). Los cambios de este tipo, denominados mutaciones finalizadoras, se han estudiado durante décadas y a ellos se atribuye cerca de 30% de las alteraciones hereditarias en seres humanos. Los codones de terminación prematura, como también se les llama, asimismo se introducen por lo general en los mRNA durante el corte y empalme. Las células poseen un mecanismo de vigilancia del mRNA capaz de detectar mensajes con codones de terminación prematura. En la mayor parte de los casos, los mRNA que contienen tales mutaciones se traducen sólo una vez antes de ser destruidos de manera selectiva por un proceso llamado deterioro mediado por falta de codificación (NMD, nonsense-mediated decay). Éste mecanismo protege a la célula de la producción de proteínas cortas no funcionales.

¿Cómo puede una célula distinguir entre un codón de terminación legítimo que debe finalizar la traducción de un mensaje y un codón de terminación prematura? Para resolver este acertijo, deben recordarse los sucesos que ocurren durante el procesamiento del pre-mRNA en las células de los mamíferos. Aún no se ha mencionado, pero cuando un empalmosoma remueve un intrón, un complejo de proteínas se deposita en el transcrito 20 a 24 nucleótidos en dirección 5′ de la unión exón-exón recién formada. Este conglomerado de proteínas se conoce como complejo de unión exónica (EJC, exon-junction complex), el cual permanece unido al mRNA hasta que éste se traduce. En un mRNA normal, el codón de terminación casi siempre está presente en el último exón y el EJC está justo en dirección 5′ de ese sitio. Se piensa que cuando un mRNA experimenta su ciclo inicial de traducción, los EJC son desplazados por el avance del ribosoma. Considérese lo que pasaría en la traducción de un mRNA que tuviera un codón de terminación prematura. El ribosoma se detendría en el sitio de la mutación y entonces se disociaría, dejando cualesquiera EJC que estuvieran unidos al mRNA en dirección 3′ del sitio de la terminación prematura. Esto pone en marcha una serie de sucesos que provocan la destrucción enzimática del mensaje anormal.

El NMD es mejor conocido por su participación en la eliminación de mRNA transcritos a partir de genes mutantes, como los causantes de la fibrosis quística o la distrofia muscular. En el caso de heterocigotos que portan un alelo normal y otro patógeno, el NMD puede eliminar la proteína codificada por el alelo mutante y de este modo evita un efecto que puede ser tóxico. En el caso de homocigotos que portan dos alelos patógenos, el NMD en realidad puede ser muy dañino porque impide la producción de acortadas proteínas mutantes que a menudo poseen moderada actividad. Diversas compañías biotecnológicas están desarrollando fármacos que interfieran el NMD o permitan a los ribosomas leer a través de un codón de terminación prematura, en vez de finalizar la traducción. Los dos tipos de fármacos deberían permitir que RNA con codones de terminación se traduzcan en proteínas. Aunque la proteína codificada por el gen mutante sea más corta de lo normal, es posible que aun así tenga suficiente actividad residual para rescatar al paciente de una enfermedad que sería letal en caso contrario.

El NMD es otro recordatorio de la naturaleza oportunista de la evolución biológica. Ésta ha “tomado ventaja” de la presencia de intrones para facilitar el intercambio de exones (pág. 454), pero también ha utilizado el proceso por el cual estos insertos genéticos se remueven para establecer un mecanismo de control de calidad, el cual garantiza que sólo mRNA íntegros avancen a un estado en el que pueden traducirse.

Polirribosomas

Cuando se examina a un mRNA en proceso de traducción por medio de microscopia electrónica, se observa que numerosos ribosomas están unidos a lo largo de la cadena. Este complejo ribosómico unido al mRNA se conoce como polirribosoma o polisoma (fig. 11.52a). De manera inicial, cada uno de los ribosomas se ensambla a partir de sus subunidades en el codón de iniciación y luego se desplaza hacia el extremo 3′ del mRNA hasta alcanzar un codón de terminación. Conforme cada ribosoma se mueve del codón de iniciación, otro ribosoma se fija al mRNA y comienza su actividad de traducción. La tasa a la que ocurre el inicio de la traducción varía con el mRNA que se estudie; algunos mRNA tienen mucha mayor densidad de ribosomas relacionados en comparación con otros. La traducción simultánea del mismo mensajero por medio de un gran número de ribosomas incrementa en grado notorio la tasa de síntesis de proteínas dentro de la célula. Estudios recientes con tomografía crioelectrónica (sección 18.2) sugirieron que la disposición tridimensional y la orientación de los ribosomas dentro de un polisoma “libre” (p. ej., no unido a una membrana) son bastante ordenados. La figura 11.52b muestra un modelo de un polisoma generado con esta técnica. Los ribosomas que conforman este polisoma modelo están en un conjunto denso y adoptaron una disposición en “doble fila”. Además, cada uno de los ribosomas individuales se orienta de tal manera que su polipéptido naciente (filamentos rojos o verdes) se sitúe en su superficie externa, apuntando hacia el citosol. Se sugiere que esta orientación maximiza la distancia entre las cadenas nacientes, lo que disminuye la probabilidad de que éstas interactúen entre sí y tal vez se agreguen. La figura 11.52c muestra una micrografía electrónica de polisomas unidos a la superficie citosólica de la membrana del retículo endoplásmico. Se presume que estos polirribosomas participaban en la síntesis de las proteínas de la membrana y/o de algún organelo en el momento en el que se fijó la célula (pág. 282). Los ribosomas de cada polisoma parecen organizarse en la superficie de la membrana del ER en un asa circular o en una espiral.

Ahora que se han descrito los sucesos básicos de la traducción es necesario cerrar el capítulo con imágenes del proceso, tomadas de una célula procariota (fig. 11.53a) y otra eucariota (fig. 11.53b). A diferencia de las células con organelos membranosos, en las que la transcripción tiene lugar en el núcleo y la traducción en el citoplasma a través de diferentes pasos, las actividades correspondientes en células procariotas están acopladas de manera estrecha. Por lo tanto, la síntesis de proteínas en células bacterianas comienza en plantillas de mRNA antes de que la síntesis de éste concluya. La producción de un mensajero procede en la misma dirección que la traducción por parte de los ribosomas, es decir, avanza del extremo 5′ al 3′. En consecuencia, tan pronto como una molécula de RNA ha comenzado a sintetizarse, el extremo 5′ está disponible para la unión de los ribosomas. La micrografía de la figura 11.53a muestra un DNA siendo transcrito, moléculas de mRNA en proceso de síntesis y los ribosomas que traducen a cada una de ellas. Las cadenas de proteínas producidas no se observan en la micrografía de la figura 11.53a, pero son visibles en la imagen de la figura 11.53b, que muestra un solo polirribosoma aislado de una célula glandular de un gusano de seda. La proteína de seda que se está sintetizando es visible por su gran tamaño y naturaleza fibrosa. El desarrollo de técnicas para visualizar la transcripción y la traducción, obra de Oscar Miller Jr., ha posibilitado una demostración visual del proceso que se describió con anterioridad en términos bioquímicos.

La comprensión de la relación que hay entre los genes y las proteínas es resultado de algunas observaciones clave. El primer hallazgo importante se debe a Garrod, quien aseguró que las personas que sufren enfermedades metabólicas hereditarias carecen de enzimas específicas. Más adelante, Beadle y Tatum indujeron mutaciones en genes de Neurospora e identificaron las reacciones metabólicas específicas afectadas. Estos estudios condujeron al concepto de “un gen-una enzima” y más adelante a la versión más depurada de “un gen-una cadena polipeptídica” (pág. 427).

El primer paso en la expresión de un gen es la transcripción de una cadena de la plantilla de DNA, que efectúa una RNA polimerasa. Las moléculas de la polimerasa se dirigen al sitio apropiado sobre el DNA al unirse a una región promotora, que en casi todos los casos se halla justo delante del sitio en que se inicia la transcripción. La polimerasa se desplaza en sentido 3′ a 5′ a lo largo de la cadena de DNA que sirve como plantilla y ensambla una cadena complementaria y antiparalela de RNA, que se proyecta desde su extremo terminal 5′ en dirección 3′. A cada paso a lo largo de la cadena, la enzima cataliza una reacción en la cual se hidrolizan ribonucleósidos trifosfatados (NTP, ribonucleoside triphosphates) para transformarse en nucleósidos monofosfatados conforme se incorporan. La reacción también se controla por hidrólisis del pirofosfato liberado. Los procariotas poseen un solo tipo de RNA polimerasa que puede relacionarse con varios factores σ diferentes, que determinan qué genes se transcriben. El sitio donde se inicia la transcripción se establece por una secuencia de nucleótidos localizada unas 10 bases en dirección 5′ del sitio de iniciación (pág. 429).

Las células eucariotas tienen tres RNA polimerasas distintas (I, II y III), cada una encargada de la síntesis de diferentes grupos de RNA. Alrededor de 80% del RNA celular es RNA ribosómico (rRNA). La RNA polimerasa I sintetiza los RNA ribosómicos (con excepción de las especies 5S); la RNA polimerasa III, el RNA de transferencia y el rRNA 5S; y la RNA polimerasa II el mRNA. Los tres tipos de RNA derivan de transcritos primarios que son más largos que el producto final. El procesamiento del RNA requiere una gran variedad de RNA nucleares pequeños (snRNA) (pág. 433).

Tres de los cuatro rRNA eucariotas (5.8S, 18S y 28S) se sintetizan a partir de una sola unidad de transcripción, constituida por DNA (rDNA), localizada dentro del nucléolo, y se procesan mediante una serie de reacciones nucleolares. Los nucléolos de ovocitos de anfibios pueden estar dispersos para revelar el rDNA en transcripción activa, que toma la forma de una cadena de “árboles de navidad”. Cada uno de éstos es una unidad de transcripción, cuyas ramas pequeñas representan RNA cortos que están en un periodo temprano de transcripción, es decir, muy cercanos al sitio donde se inició la síntesis de RNA. Los análisis de estos complejos muestran ordenamientos en tándem de los genes de rRNA y la presencia de espaciadores no transcritos que separan las unidades de transcripción y ribonucleoproteínas relacionadas (RNP) que intervienen en el procesamiento de los transcritos. Se han estudiado los pasos del procesamiento del rRNA al exponer a las células de mamíferos en cultivo a los precursores marcados, como [¹⁴C]metionina, cuyos grupos metilo se transfieren a diferentes nucleótidos del pre-rRNA. La presencia de los grupos mencionados protege al parecer a ciertos sitios en el RNA del corte mediante las nucleasas y contribuye al plegamiento de la molécula de RNA. Cerca de la mitad de los transcritos primarios 45S se elimina durante el curso de la formación de los productos de los tres rRNA maduros. El nucléolo es también el sitio de ensamblaje de dos subunidades ribosómicas (pág. 435).

Estudios de cinética de RNA que se marcan con rapidez sugirieron primero que los mRNA procedían de precursores mucho más grandes. Cuando se incubaban células eucariotas pocos minutos en uridina marcada con ³H, u otros precursores de RNA etiquetados, la mayor parte del marcador se incorpora a un grupo de moléculas de RNA de peso molecular muy elevado y a diversas secuencias de nucleótidos que sólo se encuentran en el núcleo. Este RNA se conoce como RNA nuclear heterogéneo (o hnRNA). Cuando células incubadas por un breve lapso con [³H]uridina se monitorean en un medio con precursores no marcados durante 1 h o más, la radiactividad aparece en mRNA citoplásmicos más pequeños. Éste y otros datos, como la presencia de capuchones (casquetes) 5′ y colas de poli(A) 3′ en hnRNA y mRNA, llevaron a concluir que el hnRNA es el precursor del mRNA (pág. 441).

Los pre-mRNA se sintetizan por acción de la RNA polimerasa II junto con algunos factores de transcripción general, que permiten a la enzima reconocer el sitio de DNA apropiado e iniciar la transcripción en el nucleótido adecuado. En muchos genes, el promotor se sitúa en dirección 5′ del sitio de iniciación en una región que contiene la secuencia TATA. Esta caja TATA la identifica la proteína de unión a la caja TATA (TBP), cuya unión al DNA inicia el ensamblaje de un complejo de preiniciación. La fosforilación de una porción de la RNA polimerasa provoca la separación de dicha enzima y el comienzo de la transcripción (pág. 442).

Una de las revisiones más importantes del concepto que define a un “gen” se llevó a cabo a finales del decenio de 1970, tras descubrir que las regiones codificantes de un gen no forman una secuencia continua de nucleótidos. Las primeras observaciones respecto a este hallazgo se efectuaron en estudios de transcripción en el genoma de adenovirus, en el cual se encontró que la porción terminal de un número diferente de mRNA se compone de la misma secuencia de nucleótidos que codifican varios segmentos discontinuos en el DNA. Las regiones entre los segmentos codificantes se conocen como secuencias de interferencia o intrones. Una condición semejante se identificó pronto en los genes celulares, como los que codifican a la globina β y la ovoalbúmina. En este caso, las regiones del DNA que codifican porciones del polipéptido (exones) se separan la una de la otra por secuencias no codificantes (intrones). Análisis posteriores indicaron que el gen se transcribe en su totalidad formando un transcrito primario. Después, las regiones correspondientes a los intrones se eliminan del pre-mRNA y los extremos codificantes adyacentes se ligan. Este proceso de eliminación y ligación se conoce como corte y empalme del RNA (pág. 444).

Los principales pasos en el procesamiento de los transcritos primarios para transformarlos en mRNA incluyen la adición de un capuchón 5′, la formación de un extremo 3′, la adición de una cola poli(A) 3′ y la eliminación de intrones. La formación del casquete 5′ ocurre por reacciones secuenciales en las cuales se elimina el fosfato terminal, un GMP se une en una orientación invertida y grupos metilo se transfieren a la guanosina agregada y al primer nucleótido del transcrito mismo. El extremo 3′ del mRNA se genera por la división del transcrito primario y la adición de residuos de adenosina, uno a la vez, mediante la polimerasa de poli(A). La eliminación de los intrones del transcrito primario depende de la presencia de residuos invariables en los sitios 5′ y 3′ del empalme sobre cualquier lado de cada intrón. El corte y empalme se efectúan por medio de un empalmosoma que contiene varias proteínas y partículas ribonucleoproteínicas (snRNP) que se ensamblan de forma gradual en el sitio donde se retira el intrón. Ciertos estudios sugieren que los snRNA de los empalmosomas, tal vez junto con las proteínas, son los componentes con actividad catalítica de las snRNP. Uno de los beneficios aparentes del corte de genes es la facilidad con la cual los exones pueden intercambiarse dentro del genoma y generar nuevos genes a partir de porciones de los preexistentes (pág. 448).

La mayor parte de las células eucariotas tiene un mecanismo llamado interferencia del RNA inducido por RNA bicatenarios, el cual lleva a la destrucción de mRNA complementarios. La interferencia del RNA ha evolucionado al parecer como mecanismo de defensa contra infecciones viral o la movilidad de los transposones. Los investigadores han tomado ventaja de este fenómeno como una herramienta para detener la síntesis de proteínas específicas, utilizando como blancos sus mRNA. Los genomas eucariotas codifican grandes cantidades de pequeños micro-RNA (miRNA), de 20 a 25 nucleótidos de longitud, que regulan la traducción de mRNA específicos. Tanto los siRNA como los miRNA se generan a través de una maquinaria de procesamiento común que incluye a la enzima Dicer, que divide al precursor, y a un complejo efector RISC, que sujeta la guía de RNA monocatenario que corta el mRNA o bloquea su traducción. Una tercera clase de pequeños RNA reguladores, llamados piRNA, se forma a partir de precursores de RNA monocatenarios y no requiere de la enzima Dicer durante su generación. Los piRNA permanecen activos para suprimir la movilidad de elementos transponibles en las células germinales (pág. 455).

La información para la incorporación de aminoácidos en un polipéptido está codificada en las secuencias de codones del mRNA. Además de encontrarse en forma de tripletes, el código genético no está superpuesto y es del tipo degenerado. En un código no superpuesto, cada nucleótido es parte de sólo un codón, por lo tanto, el ribosoma debe moverse a lo largo del mensaje tres nucleótidos a la vez. El ribosoma se une al mRNA en el codón de inicio, AUG, el cual pone automáticamente al ribosoma en un marco de lectura adecuado para que lea de modo correcto el mensaje por entero. El código de tripletes construido de cuatro diferentes nucleótidos puede tener 64 (4³) codones diferentes. El código es degenerado porque muchos de sus 20 aminoácidos distintos tienen más de un codón. De los 64 posibles tripletes, 61 especifican a un aminoácido, mientras que los otros tres son codones de terminación que llevan al ribosoma a concluir la traducción. La asignación de codones es en esencia universal y sus secuencias son tales que la sustitución de bases en el mRNA tiende a reducir al mínimo el efecto sobre las propiedades del polipéptido (pág. 461).

El RNA de transferencia codifica la información del alfabeto nucleotídico del DNA y del RNA durante el procesamiento de la traducción. Los RNA de transferencia son pequeñas secuencias (de 73 a 93 nucleótidos de longitud) que muestran similitud y tienen forma de L, una estructura tridimensional y un número de residuos invariables. Un extremo del tRNA porta el aminoácido y el otro contiene una secuencia anticodón de tres nucleótidos que es complementaria de un codón del mRNA. Los requerimientos estéricos de complementariedad entre el codón y el anticodón disminuyen en la tercera posición del triplete, para así permitir la existencia de diferentes codones que codifican el mismo aminoácido usando el mismo tRNA. Es esencial que cada tRNA se una a un aminoácido propio (específico), es decir, el residuo codificado por el codón de mRNA al cual el anticodón de tRNA se une. La unión de un tRNA a su propio aminoácido la lleva a cabo un grupo de enzimas conocidas como aminoacil-tRNA sintetasas. Cada enzima es específica para uno de los 20 aminoácidos y es capaz de reconocer todos los tRNA, y a los cuales el aminoácido debe unirse (pág. 464).

La síntesis de proteínas es una actividad compleja que incluye a todos los diferentes tRNA con sus aminoácidos, a los cuales se unen los ribosomas, el mRNA, varias proteínas, ciertos cationes y moléculas de GTP. El proceso se divide en tres actividades: iniciación, elongación (o alargamiento) y terminación. Las actividades principales de la iniciación incluyen la unión precisa de la subunidad ribosómica pequeña al codón de inicio del mRNA, que establece el marco de lectura para todo el proceso de traducción; la entrada de un tRNA iniciador especial al ribosoma, y el ensamblado del mecanismo de traducción. Durante la elongación ocurre un ciclo de entrada de tRNA, la formación de enlaces peptídicos y la salida del tRNA, lo cual inicia otro ciclo con cada aminoácido incorporado. El aminoacil-tRNA penetra en el sitio A, donde se une al codón complementario del mRNA. Conforme entra cada tRNA, el polipéptido emergente fijado al tRNA del sitio P se transfiere al aminoácido sobre el tRNA del sitio A y forma un enlace peptídico. Una porción del rRNA grande que actúa como ribozima cataliza la formación de enlaces peptídicos. En el último paso de la elongación, el ribosoma se trasloca al siguiente codón del mRNA, a medida que el tRNA desacilado del sitio P se transfiere al sitio E y después se libera del ribosoma. La iniciación y la elongación requieren la hidrólisis de GTP. La traducción termina cuando el ribosoma alcanza uno de los tres codones de terminación. Después que un ribosoma se ensambla en el codón de inicio y se desplaza una distancia corta hacia el extremo 3′ del mRNA, casi siempre otro ribosoma se fija al codón de inicio, de tal modo que varios de estos organelos traducen cada mRNA de manera simultánea, lo que incrementa en gran medida la tasa de síntesis de proteínas dentro de la célula. El complejo formado por un mRNA y sus ribosomas acompañantes constituye un polirribosoma (pág. 468).

1. Al observar el código de codones de la figura 11.40, ¿cuáles cabría esperar que tuvieran un tRNA único, es decir, que sólo utilice un codón?, ¿por qué muchos codones carecen de su propio tRNA único?

2. La proflavina es un compuesto que se inserta por sí mismo dentro del DNA y causa mutaciones que cambian el marco de lectura (pág. 473). ¿De qué forma el efecto sobre la secuencia aminoacídica de una mutación inducida por flavina difiere entre un código superpuesto y uno no superpuesto?

3. Suponga que se ha aislado un nuevo fármaco que tiene un solo efecto en el metabolismo celular; este agente inhibe por completo la transformación de pre-rRNA en RNA ribosómico. Después de tratar un cultivo de células de mamífero con este fármaco, se suministra a las células [³H]uridina durante 2 minutos. Luego, las células se cultivan en presencia del medicamento en un medio no marcado durante 4 h antes de extraer el RNA y centrifugarlo a través de un gradiente de sacarosa. Dibújense las curvas que se obtendrían tras registrar la absorbancia a 260 nm y la radiactividad contra la fracción obtenida del gradiente. Márquese la abscisa (eje X) con valores “S” del RNA.

4. Con base en los mismos parámetros de la pregunta anterior, trácese el perfil del RNA radiactivo que debería obtenerse después de incubar un cultivo de células de mamífero durante 48 h en [³H]uridina sin ningún fármaco inhibidor.

5. Asúmase que se elabora un RNA sintético a partir de un dinucleótido repetitivo (p. ej., AGAGAGAG) que luego se utiliza como mensajero para sintetizar un polipéptido en un sistema sintetizador de proteínas in vitro, como el que emplearon Nirenberg y Matthaei para producir polifenilalanina. ¿Qué tipo de polipéptido se esperaría producir a partir de este polinucleótido en particular?, ¿se produciría más de un tipo de polipéptido?, ¿por qué?

6. Si se hallara una enzima que incorporara al azar nucleótidos formando un polímero sin el requerimiento de un plantilla, ¿cuántos codones diferentes podrían encontrarse en RNA sintéticos elaborados con dos precursores de nucleótidos distintos (p. ej., CTP y ATP)? (Una enzima denominada fosforilasa de polinucleótido cataliza este tipo de reacción y se empleó en estudios para identificar codones.)

7. Dibuje las partes de un pre-mRNA de globina 15S y márquense las posiciones no codificantes.

8. ¿Cuál es el menor número de GTP necesario para sintetizar un pentapéptido en una bacteria?

9. En los mismos ejes de la figura 10.17, trácense dos curvas de renaturalización, una para el DNA extraído del tejido cerebral de Xenopus y otra para el DNA extraído de ovocitos de Xenopus.

10. ¿Es cierto o falso que el descubrimiento de que la drepanocitosis es resultado del cambio de un solo aminoácido demuestra que el código genético no está superpuesto? ¿Por qué?

11. La talasemia es una enfermedad caracterizada por mutaciones que convierten codones correspondientes a aminoácidos en tripletes de terminación. Supóngase que se deben comparar los polipéptidos sintetizados in vitro a partir de mRNA purificados de una gran variedad de pacientes con talasemia. ¿Cómo se esperaría que se compararan estos polipéptidos? Obsérvese el código de la figura 11.40; ¿cuántos codones de aminoácidos pueden convertirse en codones de terminación al sustituir una sola base?

12. ¿Es teóricamente posible obtener un código genético con sólo dos letras, A y T? Si es así, ¿cuál sería el menor número de nucleótidos requeridos para elaborar un codón?

13. En la página 454 se describen los experimentos que llevaron a la síntesis de ribozimas con propiedades catalíticas únicas. En el año 2001, una ribozima artificial que se aisló fue capaz de incorporar más de 14 ribonucleótidos en el extremo de un RNA existente al usar una cadena de RNA como plantilla. La enzima puede emplearse en cualquier secuencia de RNA como plantilla (molde) y podría agregar nucleótidos complementarios en una cadena de RNA de novo con una precisión de 98.5%. Si el lector fuera un defensor del “mundo de RNA” antiguo, ¿cómo debería usarse este hallazgo para apoyar su caso?, ¿prueba esto que hubo un mundo de RNA antiguo? Si es así, ¿cuál sería la evidencia más sólida de la existencia de dicho mundo?

14. Aunque el mRNA es muy escaso dentro de las células procariotas, ¿Cómo es posible que su síntesis ocurra a una mayor tasa en las bacterias que en cualquier otro tipo de células?

15. Si un codón para serina es 5′-AGC-3′, el anticodón correspondiente sería 5′- — — — -3′. ¿Cómo afectaría el fenómeno de bamboleo a esta interacción codón-anticodón?

16. Uno de los principales argumentos que sustentan que las proteínas evolucionaron antes que el DNA (es decir, que el mundo de RNA se transformó en un mundo de RNA y proteínas en vez de en un mundo de RNA-DNA) se basa en el hecho de que la maquinaria de la traducción incluye una gran variedad de RNA (p. ej., tRNA y rRNA), mientras que el mecanismo de transcripción no muestra evidencia de la participación del RNA. ¿Explíquese cómo tal argumento sobre las etapas tempranas de la evolución puede basarse en estas observaciones?

17. Las mutaciones que cambian el marco de lectura y las no codificantes se describieron en la página 474. Se observó que las segundas llevan a menudo a la destrucción por NMD de un mRNA que contiene un codón de terminación prematuro. ¿Se esperaría que los mRNA que contienen mutaciones con cambio del marco de lectura fueran sometidos a NMD?

18. Las puntas de flecha de la figura 11.16 indican la dirección de la transcripción de varios genes de tRNA. ¿Qué indica este dibujo acerca de la actividad de las plantillas de cada cadena de una molécula de DNA dentro de un cromosoma?

19. Los genes se descubren casi siempre al encontrar un fenotipo anormal resultante de una mutación genética. De manera alternativa, pueden reconocerse al examinar las secuencias de DNA de un genoma. ¿Por qué se supone que los genes que codifican a los miRNA no se descubrieron hasta hace poco?

20. En la página 464 se dijo que los cambios sinónimos de codones por lo general no alteran el fenotipo de un organismo. ¿Puede concebirse algún escenario en el que esto no sea verdad? ¿Qué indica esto sobre las necesidades de codificación del material genético?