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La síntesis de proteínas, o traducción, quizá sea la actividad sintética más compleja en una célula. El ensamblaje de una proteína requiere todos los diferentes tRNA con sus aminoácidos unidos, ribosomas, un mRNA, algunas proteínas con funciones distintas, cationes y GTP (trifosfato de guanosina). La complejidad no es sorprendente si se considera que la síntesis de proteínas necesita la incorporación de 20 aminoácidos diferentes en el orden preciso según un mensaje codificado en un lenguaje que emplea diversos elementos. En la descripción siguiente se analizan sobre todo los mecanismos de traducción que operan en las células bacterianas, que son más simples y mejor conocidos. El proceso es muy similar en las células eucariotas.
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La síntesis de una cadena polipeptídica puede dividirse en tres actividades muy diferentes: iniciación, elongación, y terminación de la cadena. A continuación se describe cada una de estas actividades.
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Una vez que se une a un mRNA, el ribosoma siempre se mueve a lo largo de él pasando de un codón al próximo, es decir, en bloques consecutivos de tres nucleótidos. Para asegurar que se lean los tripletes apropiados, el ribosoma se une al mRNA en un sitio preciso denominado codón de iniciación, el cual corresponde al triplete AUG. La unión a este codón pone al ribosoma de manera automática en el marco de lectura apropiado, de tal modo que el ribosoma lee el mensaje entero de manera correcta, desde este punto de inicio. Por ejemplo, en el caso siguiente:
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el ribosoma se mueve del codón de inicio, AUG, a los próximos tres nucleótidos, CUC, luego a CAG, y así de forma sucesiva a lo largo de toda la secuencia.
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En la figura 11.46 se ilustran los pasos básicos del inicio de la traducción en las células bacterianas.
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Paso 1: traslado de la subunidad ribosómica pequeña al codón de iniciación
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Como se advierte en la figura 11.46, un mRNA no se une a un ribosoma intacto, sino a las subunidades pequeña y grande en estadios separados. El primer paso relevante de la iniciación es la unión de la subunidad ribosómica pequeña a la primera secuencia AUG (o una de las iniciales) del mensaje, que sirve como el codón de iniciación.8 ¿De qué manera la subunidad pequeña selecciona el codón inicial AUG en vez de alguno interno? Los mRNA bacterianos poseen una secuencia específica de nucleótidos (de Shine-Dalgarno, nombrada así por sus descubridores) que se localiza 5 a 10 nucleótidos antes del codón de iniciación. La secuencia Shine-Dalgarno es complementaria de una secuencia de nucleótidos próxima al extremo 3′ del RNA ribosómico 16S de la subunidad ribosómica pequeña.
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La interacción entre estas secuencias complementarias en el mRNA y el rRNA coloca la subunidad 30S en el codón de iniciación AUG.
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La iniciación requiere factores de inicio Varios de los pasos que se describen en la figura 11.46 necesitan la ayuda de proteínas solubles, denominadas factores de iniciación (designados como IF en procariotas y eIF en eucariotas). Las células bacterianas necesitan tres de estos factores (IF1, IF2 e IF3), los cuales se unen a la subunidad 30S (paso 1 de la fig. 11.46). El IF2 es una proteína que se une al GTP requerido para la unión del primer aminoacil-tRNA. El IF3 puede prevenir que la subunidad grande (50S) se una en forma prematura a la subunidad pequeña 30S y también facilita la entrada del aa-tRNA iniciador apropiado. El IF1 facilita la unión de la subunidad 30S al mRNA y puede prevenir que el aa-tRNA entre a un sitio erróneo en el ribosoma.
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Paso 2: traslado del primer aa-tRNA al ribosoma
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Si se examinan las asignaciones de los codones (fig. 11.40), se puede observar que el triplete AUG no representa tan sólo la iniciación, sino que es el único que codifica a la metionina. En realidad, dicho residuo siempre es el primer aminoácido que se incorpora en el extremo terminal-N de un polipéptido naciente (en procariotas, la metionina inicial porta un grupo formilo, que la convierte en N-formilmetionina). Luego, la metionina (o N-formilmetionina) se elimina por medios enzimáticos de la mayoría de las proteínas recién sintetizadas. Las células poseen dos metionil-tRNA: uno se utiliza en el inicio de la síntesis proteínica y otro diferente incorpora residuos de metionilo en el interior del polipéptido. Gracias al IF2, el aa-tRNA iniciador entra en el sitio P del ribosoma (paso 2 de la fig. 11.46), donde se une al codón AUG del mRNA y los factores IF1 e IF3 se liberan.
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Paso 3: ensamblaje del complejo de iniciación completo
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Una vez que el tRNA iniciador se une al codón AUG y el IF3 se desplaza, la subunidad grande se adhiere al complejo y el GTP incorporado al IF2 se hidroliza (paso 3 de la fig. 11.46). Es probable que la hidrólisis de GTP genere un cambio conformacional en el ribosoma, necesario para la liberación del IF2 unido a GDP.
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Inicio de la traducción en eucariotas
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Los ribosomas eucariotas contienen rRNA de mayor tamaño y proteínas adicionales, mientras que los mRNA poseen características especializadas como casquetes 5′ y colas de poli(A). No es sorprendente que el inicio de la traducción en los organismos eucariotas sea totalmente diferente y más complejo que en las bacterias y, además, que constituya una fase importante en la cual se ejerce control sobre la expresión génica (véase la sección 12.6). Las células con organelos membranosos necesitan por lo menos 12 factores de iniciación que incluyen un total de más de 25 cadenas polipeptídicas. Como se indica en la figura 11.47, varios de estos eIF (p. ej., eIF1, eIF1A y eIF3) se unen a la subunidad 40S, lo cual la alista para su unión con el mRNA. El tRNA iniciador ligado a una metionina también se une a una subunidad 40S antes de su interacción con el mRNA y después entra en el sitio P de la subunidad en asociación con el complejo eIF2-GTP. Una vez que estos sucesos se llevan a cabo, la subunidad ribosómica pequeña con sus factores de iniciación relacionados y el tRNA cargado (que juntos integran un complejo de preiniciación 43S) está lista para encontrar el extremo 5′ del mRNA, que tiene el casquete de metilguanosina (pág. 448).
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Al principio, el complejo 43S se desplaza hacia el mRNA con la ayuda de un grupo de factores de iniciación que ya se encuentran unidos al mRNA (fig. 11.47). De estos factores: (1) el eIF4E se une al casquete 5′ del mRNA de eucariotas; (2) el eIF4A se moviliza a lo largo del extremo 5′ del mensaje y remueve cualquier región de doble cadena que podría interferir con el movimiento del complejo 43S a lo largo del mRNA, y (3) el eIF4G sirve como un puente entre el extremo 5′ con el casquete y la cola de poli(A) del mRNA (fig. 11.47). De esta forma, el eIF4G convierte un mRNA lineal en un mensaje circular.
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Una vez que el complejo 43S se une al extremo 5′ del mRNA, recorre el mensaje hasta reconocer una secuencia nucleotídica (por lo general el 5′—CCACCAUGC—3′) que contenga el codón de iniciación AUG. Cuando esto ocurre, se hidroliza el GTP unido al eIF2 y la subunidad grande (60S) se une al complejo. La formación del ribosoma 80S completo necesita de la actividad de otra proteína ligadora de GTP llamada eIF5B-GTP, cuyo enlace con GTP también es hidrolizado. La rotura de los dos GTP unidos y la formación del ribosoma completo se acompañan de la liberación de todos los factores de iniciación. Los fenómenos en cuestión dejan al anticodón de tRNA iniciador unido al codón de comienzo AUG en el sitio P del ribosoma ensamblado. En este momento, el complejo está listo para la primera fase de la elongación.9,10
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Función de los ribosomas
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Tras alcanzar el punto en el cual se ha ensamblado por completo un ribosoma, es posible ver de manera más detallada la estructura y la función de esta estructura de múltiples subunidades. Los ribosomas son máquinas moleculares, similares en algunos aspectos a los motores descritos en el capítulo 9. Durante la traducción, un ribosoma experimenta un ciclo repetitivo de cambios mecánicos impulsado por la energía liberada por la hidrólisis de GTP. A diferencia de la miosina o la cinesina, las cuales de forma simple se mueven a lo largo de una estructura física, los ribosomas se desplazan sobre una “cinta” de mRNA (que contiene la información codificada). En otras palabras, los ribosomas son máquinas programables: la información almacenada en los mRNA determina la secuencia de los aminoacil-tRNA que el ribosoma acepta durante la traducción. Otra característica que distingue a los ribosomas de muchas otras máquinas celulares es la importancia de los RNA que lo componen. Los RNA ribosómicos ejercen funciones esenciales en la selección de los tRNA y aseguran una traducción precisa al unir factores proteínicos y polimerizar aminoácidos (este aspecto se revisa en la sección “Vías experimentales” al final del capítulo).
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En los últimos años avanzó en gran medida la comprensión de la estructura de los ribosomas bacterianos. Los estudios iniciales que emplearon microscopia crioelectrónica de alta resolución (sección 18.8) revelaron que el ribosoma tenía una estructura muy irregular con lóbulos, protuberancias, conductos y puentes (fig. 2.56). Estos ensayos también proporcionaron información sobre los principales cambios conformacionales que ocurren en las subunidades pequeña y grande durante la traducción. Durante la década de 1990 se hicieron grandes avances en la cristalización de los ribosomas y para el final de esa década aparecieron los primeros informes sobre la estructura de los ribosomas de procariotas obtenida por cristalografía por rayos X. La figura 11.48a,b muestra la estructura general de las dos subunidades de un ribosoma bacteriano, tal como lo revela la cristalografía por rayos X. En fecha reciente esta técnica se ha utilizado con éxito en el estudio de ribosomas eucariotas de mayor tamaño, que comparten con sus equivalentes procariotas las mismas estructuras centrales y funciones primarias.
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Cada ribosoma tiene tres regiones para la vinculación de moléculas de RNA de transferencia. Estas áreas, denominadas sitio A (aminoacilo), sitio P (peptidilo) y sitio E (de salida), reciben cada tRNA en pasos sucesivos del ciclo de elongación, como se describe en la siguiente sección. Las posiciones de los tRNA unidos a los sitios A, P y E de las subunidades pequeña y grande de los ribosomas se muestran en la figura 11.48a,b. Los tRNA se unen dentro de estas regiones y abarcan el espacio que hay entre las dos unidades ribosómicas (fig. 11.48c). Los extremos de los anticodones de los tRNA unidos hacen contacto con la subunidad pequeña, la cual tiene una función importante al decodificar la información contenida en el mRNA. En cambio, los extremos que unen a los aminoácidos del tRNA contactan a la subunidad grande, que posee una función relevante al catalizar la formación de los enlaces peptídicos. Otras características importantes que han sido reveladas por estos análisis estructurales de alta resolución incluyen lo siguiente:
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La interfase entre las subunidades grande y pequeña forma una cavidad relativamente espaciosa (fig. 11.48c) ocupada casi de modo exclusivo por RNA. La porción de la subunidad pequeña que limita a esta cavidad está delineada por una hélice continua de RNA bicatenario. Ésta aparece sombreada en la estructura bidimensional del rRNA16S en la figura 11.3. Las superficies de las dos subunidades que se enfrentan la una a la otra contienen los sitios de unión para el mRNA y los tRNA entrantes y, por lo tanto, son esenciales para la función del ribosoma. El hecho de que estas superficies se integren en su mayor parte con RNA apoya la propuesta de que los ribosomas primigenios estaban formados casi de manera exclusiva por ácido ribonucleico (pág. 454).
El sitio activo, donde se unen de modo covalente los aminoácidos, también está formado por RNA. Esta porción catalítica de la subunidad grande reside en una cavidad profunda, la cual impide que el enlace peptídico recién formado sea hidrolizado por el solvente acuoso.
El mRNA se halla en un conducto estrecho que rodea el cuello de la subunidad pequeña y pasa a través de los sitios A, P y E. Antes de entrar al sitio A, el mRNA se deshace de cualquier estructura secundaria que pudiera ostentar mediante la actividad helicasa del ribosoma.
Un túnel se proyecta a través del núcleo de la subunidad grande desde el sitio activo. Dicho corredor provee una vía para la translocación del polipéptido creciente a través del ribosoma (fig. 11.48c).
La mayor parte de las proteínas de las subunidades ribosómicas tiene múltiples sitios de unión para RNA y se ubica en posiciones ideales para estabilizar la compleja estructura terciaria de los rRNA.
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Los pasos básicos del proceso de elongación de la traducción en células bacterianas se ilustran en la figura 11.49. Esta serie de pasos se repite una y otra vez conforme se polimerizan los aminoácidos en la cadena polipeptídica en crecimiento.
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Paso 1: selección del aminoacil-tRNA
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Con el tRNA iniciador cargado y en posición dentro del sitio P, el ribosoma queda disponible para la entrada de un segundo aminoacil-tRNA en el sitio A vacante, lo cual representa el primer paso de la elongación (paso 1, fig. 11.49a). Antes de que el segundo aminoacil-tRNA se una de manera eficiente al mRNA expuesto en el sitio A, debe combinarse con un factor de elongación de proteína unido a GTP, que se conoce como EF-Tu (o Tu) en procariotas y eEF1A en eucariotas. El EF-Tu es necesario para introducir los aminoacil-tRNA en el sitio A del ribosoma. Aunque cualquier complejo aminoacil-tRNA—Tu-GTP puede ingresar al sitio, sólo el que tiene el anticodón complementario del codón del mRNA alojado en el sitio A activará los cambios conformacionales necesarios dentro del ribosoma que hacen que el tRNA permanezca unido al mRNA en el centro de decodificación. Una vez que el aminoacil-tRNA—Tu-GTP correcto se une al codón del mRNA, el GTP se hidroliza y el complejo Tu-GDP se libera, dejando al aa-tRNA situado en el sitio A del ribosoma. La regeneración de Tu-GTP a partir del Tu-GDP liberado requiere otro factor de elongación llamado EF-Ts.
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Paso 2: formación del enlace peptídico
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Al final del primer paso, los dos aminoácidos (unidos a sus tRNA separados) yacen yuxtapuestos y alineados de manera precisa para poder reaccionar entre sí (fig. 11.48a′,b′). El segundo paso en el ciclo de elongación es la formación de un enlace peptídico entre estos dos aminoácidos (paso 2, fig. 11.49a), el cual se realiza cuando el nitrógeno del grupo amino del aa-tRNA en el sitio A reacciona con el carbono del grupo carbonilo del aminoácido unido al tRNA del sitio P, desplazándolo (fig. 11.49b). Como resultado de esta reacción, el tRNA unido al segundo codón en el sitio A tiene un dipéptido unido, mientras que el tRNA en el sitio P se desacila. La formación del enlace peptídico ocurre de manera espontánea sin la utilización de energía externa. La transferasa de peptidilo, un componente de la subunidad ribosómica grande, cataliza la reacción. Durante años se asumió que dicha enzima era una de las proteínas del ribosoma. Sin embargo, conforme resultó evidente la potencia catalítica del ácido ribonucleico, la atención se volvió al RNA ribosómico como posible catalizador para la formación de enlaces peptídicos. En la actualidad se ha demostrado que la actividad de transferasa de peptidilo reside en la molécula grande de RNA ribosómico de la subunidad 60S (véase la fotografía en la página inicial de este capítulo). En otras palabras, la transferasa de peptidilo es una ribozima, que se describe en la sección “Vías experimentales” al final del capítulo.
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Paso 3: translocación
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La formación del primer enlace peptídico deja un extremo de la molécula de tRNA del sitio A todavía fijado a su codón complementario sobre el mRNA y el otro lado de la molécula fijado a un dipéptido (paso 2 de la fig. 11.49a). El tRNA del sitio P queda entonces desprovisto de un aminoácido. La fase siguiente, llamada translocación, se caracteriza por un desplazamiento pequeño (6°) a manera de trinquete de la subunidad pequeña en relación con la subunidad grande, que se muestra en la figura 11.50a. En consecuencia, el ribosoma se desplaza un tramo de tres nucleótidos (un codón) a lo largo del mRNA en dirección 5′ → 3′ (paso 3 de la fig. 11.49a). La translocación se acompaña del movimiento (1) del dipeptidil-tRNA del sitio A al P del ribosoma y (2) del tRNA desacilado del sitio P al E. Conforme dichos desplazamientos ocurren, los dos tRNA mencionados permanecen unidos por enlaces de hidrógeno a sus codones en el mRNA. Mediante microscopia crioelectrónica se visualizó una etapa intermedia en dicho proceso, en el cual los tRNA ocupan “estados híbridos” de translocación parcial. En estas etapas, los extremos del anticodón del tRNA todavía están en los sitios A y P de la subunidad pequeña, mientras que los extremos aceptores de los tRNA ya se movieron a los sitios P y E de la subunidad grande. Se dice que los tRNA ocupan los sitios híbridos A/P y P/E, en dicho orden. En la figura 11.50b se señalan los pasos que ocurren durante el proceso de translocación. El cambio del estado “clásico” de movimiento continuo en el paso 1, figura 11.50b, al estado híbrido de desplazamiento interrumpido (paso 2) se produce de manera espontánea, es decir, sin que participen otros factores. Parecería que el ribosoma puede cambiar de un estado a otro sin estimulación. Una vez que cambió al estado híbrido, un factor de elongación unido a GTP (EF-G en bacterias y eEF2 en eucariotas) se une al ribosoma (paso 3) y lo estabiliza en el estado de desplazamiento interrumpido, impidiendo el movimiento retrógrado de los tRNA a la clásica conformación A/A y P/P. Después, la hidrólisis del GTP unido genera un cambio de conformación que mueve al mRNA y a los anticodones de los tRNA acompañantes en relación con la subunidad ribosómica pequeña, lo cual coloca a los tRNA unidos en los estados E/E y P/P, dejando al sitio A vacío (paso 4). Al mismo tiempo, el ribosoma regresa al estado de desplazamiento continuo. Después de esta reacción, el complejo EF-G-GDP se disocia del ribosoma (paso 5).
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Paso 4: liberación del tRNA desacilado
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En el paso final de la elongación (paso 4 de la fig. 11.49a), el tRNA desacilado sale del ribosoma y deja vacío el sitio E.
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Por cada ciclo de elongación, al menos dos moléculas de GTP se hidrolizan: una durante la selección del aminoacil-tRNA y una durante la translocación. Cada ciclo de elongación toma casi un veinteavo de segundo, la mayor parte del cual transcurre buscando los aa-tRNA del citosol circundante. Una vez que el peptidil-tRNA se ha movido al sitio P por translocación, el sitio A está de nueva cuenta disponible para la entrada de otro aminoacil-tRNA, en este caso uno con un anticodón complementario del tercer codón (fig. 11.49a). Cuando el tercer tRNA cargado se vincula con el mRNA en el sitio A, el dipéptido del tRNA del sitio P se transfiere al aa-tRNA del sitio A y forma el segundo enlace peptídico y, en consecuencia, un tripéptido fijado al tRNA del sitio A. El tRNA del sitio P otra vez se encuentra desprovisto de un aminoácido. A la formación de enlaces peptídicos le siguen la translocación del ribosoma al cuarto codón y la expulsión del tRNA desacilado, después de lo cual el ciclo está listo para comenzar otra vez.
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Se ha observado en esta sección de qué manera el ribosoma se mueve tres nucleótidos (un codón) a la vez a lo largo del mRNA. La secuencia particular de codones que utiliza un ribosoma (p. ej., el marco de lectura) se establece en el momento en que éste se une al codón de iniciación al comienzo de la traducción. Algunas de las mutaciones más nocivas son aquellas en las que un solo par de bases se agrega o se elimina del DNA. Se debe considerar el efecto de la adición o la deleción de uno o dos nucleótidos en una secuencia particular (fig. 11.41d). El ribosoma se mueve a lo largo del mRNA en un marco de lectura incorrecto desde la mutación. Las mutaciones de este tipo se conocen como mutaciones con cambio del marco de lectura. Tales mutaciones codifican una secuencia de aminoácidos anormal desde el punto donde ocurrió la mutación. Puede observarse que, después de más de dos décadas en las cuales se asumió que el ribosoma siempre se mueve de un triplete al próximo, se descubrieron varios ejemplos en los que los mRNA contenían una señal de recodificación que daba lugar a que el ribosoma cambiara su marco de lectura, retrocediendo (un desplazamiento al marco −1) o avanzando (un desfase al marco +1) un nucleótido.
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Una gran cantidad de antibióticos ejerce su efecto al interferir con diferentes aspectos de la síntesis de proteínas en células bacterianas. Por ejemplo, la estreptomicina actúa por medio de la unión selectiva a la subunidad ribosómica pequeña de las bacterias y provoca que ciertos codones del mRNA se lean de manera errónea, de tal modo que se incrementa la síntesis de proteínas aberrantes. Debido a que el antibiótico no se une a los ribosomas eucariotas, carece de efecto en la traducción de los mRNA de las células del hospedador. La resistencia por parte de la bacteria a la estreptomicina puede estudiarse al observar los cambios de las proteínas ribosómicas, en particular de S12.
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Como se muestra en la figura 11.40, tres de los 64 codones funcionan como trinucleótidos de terminación que concluyen el ensamblaje del polipéptido en lugar de codificar un aminoácido. No existen tRNA cuyos anticodones sean complementarios de un codón de terminación.11 Cuando el ribosoma alcanza uno de estos codones (UAA, UAG o UGA), se interrumpe la elongación y se libera al polipéptido relacionado con el último tRNA.
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La terminación requiere de factores de liberación (RF, release factors), que pueden dividirse en dos grupos: los RF de clase I, que reconocen a los codones de detención en el sitio A del ribosoma, y los RF de clase II, que son proteínas de unión con GTP (proteínas G) cuyas funciones no se conocen del todo. Las bacterias tienen dos RF de clase I: el RF1, que reconoce a los codones de terminación UAA y UAG, y el RF2 que identifica a los codones de terminación UAA y UGA. Los organismos eucariotas tienen un solo RF de clase I, eRF1, que reconoce a los tres codones de detención. Los RF de clase I se integran al sitio A del ribosoma, como se muestra en la figura 11.51. Una vez dentro del sitio A, se cree que un tripéptido conservado en un extremo del factor de liberación interactúa con el codón de terminación en el sitio A e induce un cambio de conformación crucial que afecta a numerosos nucleótidos del mRNA de la subunidad ribosómica pequeña. Después, el enlace éster que vincula la cadena polipeptídica naciente con el tRNA se hidroliza y se libera el polipéptido completo. En este punto, la hidrólisis del GTP unido al RF de clase II (RF3 o eRF3) conduce a la liberación del RF de clase I del sitio A del ribosoma. Los pasos finales de la traducción incluyen la liberación del tRNA desacilado del sitio P, la disociación del mRNA del ribosoma y el desensamble del ribosoma en sus subunidades grande y pequeña para que éstas se utilicen en otra ronda de traducción. Estos procesos requieren varios factores proteínicos y son muy distintos entre los organismos eucariotas y las bacterias. En las últimas, tales proteínas incluyen a los factores EF-G, IF3 y RRF (ribosome recycling factor, factor reciclador de ribosomas), lo que fomenta la separación de las subunidades ribosómicas.
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Vigilancia y control de calidad de los mRNA
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Puesto que los tres codones de terminación pueden formarse por cambios de una sola base de muchos otros codones (fig. 11.40), es posible que ocurran mutaciones que produzcan codones de terminación dentro de la secuencia codificadora de un gen (fig. 11.41c). Los cambios de este tipo, denominados mutaciones finalizadoras, se han estudiado durante décadas y a ellos se atribuye cerca de 30% de las alteraciones hereditarias en seres humanos. Los codones de terminación prematura, como también se les llama, asimismo se introducen por lo general en los mRNA durante el corte y empalme. Las células poseen un mecanismo de vigilancia del mRNA capaz de detectar mensajes con codones de terminación prematura. En la mayor parte de los casos, los mRNA que contienen tales mutaciones se traducen sólo una vez antes de ser destruidos de manera selectiva por un proceso llamado deterioro mediado por falta de codificación (NMD, nonsense-mediated decay). Éste mecanismo protege a la célula de la producción de proteínas cortas no funcionales.
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¿Cómo puede una célula distinguir entre un codón de terminación legítimo que debe finalizar la traducción de un mensaje y un codón de terminación prematura? Para resolver este acertijo, deben recordarse los sucesos que ocurren durante el procesamiento del pre-mRNA en las células de los mamíferos. Aún no se ha mencionado, pero cuando un empalmosoma remueve un intrón, un complejo de proteínas se deposita en el transcrito 20 a 24 nucleótidos en dirección 5′ de la unión exón-exón recién formada. Este conglomerado de proteínas se conoce como complejo de unión exónica (EJC, exon-junction complex), el cual permanece unido al mRNA hasta que éste se traduce. En un mRNA normal, el codón de terminación casi siempre está presente en el último exón y el EJC está justo en dirección 5′ de ese sitio. Se piensa que cuando un mRNA experimenta su ciclo inicial de traducción, los EJC son desplazados por el avance del ribosoma. Considérese lo que pasaría en la traducción de un mRNA que tuviera un codón de terminación prematura. El ribosoma se detendría en el sitio de la mutación y entonces se disociaría, dejando cualesquiera EJC que estuvieran unidos al mRNA en dirección 3′ del sitio de la terminación prematura. Esto pone en marcha una serie de sucesos que provocan la destrucción enzimática del mensaje anormal.
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El NMD es mejor conocido por su participación en la eliminación de mRNA transcritos a partir de genes mutantes, como los causantes de la fibrosis quística o la distrofia muscular. En el caso de heterocigotos que portan un alelo normal y otro patógeno, el NMD puede eliminar la proteína codificada por el alelo mutante y de este modo evita un efecto que puede ser tóxico. En el caso de homocigotos que portan dos alelos patógenos, el NMD en realidad puede ser muy dañino porque impide la producción de acortadas proteínas mutantes que a menudo poseen moderada actividad. Diversas compañías biotecnológicas están desarrollando fármacos que interfieran el NMD o permitan a los ribosomas leer a través de un codón de terminación prematura, en vez de finalizar la traducción. Los dos tipos de fármacos deberían permitir que RNA con codones de terminación se traduzcan en proteínas. Aunque la proteína codificada por el gen mutante sea más corta de lo normal, es posible que aun así tenga suficiente actividad residual para rescatar al paciente de una enfermedad que sería letal en caso contrario.
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El NMD es otro recordatorio de la naturaleza oportunista de la evolución biológica. Ésta ha “tomado ventaja” de la presencia de intrones para facilitar el intercambio de exones (pág. 454), pero también ha utilizado el proceso por el cual estos insertos genéticos se remueven para establecer un mecanismo de control de calidad, el cual garantiza que sólo mRNA íntegros avancen a un estado en el que pueden traducirse.
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Cuando se examina a un mRNA en proceso de traducción por medio de microscopia electrónica, se observa que numerosos ribosomas están unidos a lo largo de la cadena. Este complejo ribosómico unido al mRNA se conoce como polirribosoma o polisoma (fig. 11.52a). De manera inicial, cada uno de los ribosomas se ensambla a partir de sus subunidades en el codón de iniciación y luego se desplaza hacia el extremo 3′ del mRNA hasta alcanzar un codón de terminación. Conforme cada ribosoma se mueve del codón de iniciación, otro ribosoma se fija al mRNA y comienza su actividad de traducción. La tasa a la que ocurre el inicio de la traducción varía con el mRNA que se estudie; algunos mRNA tienen mucha mayor densidad de ribosomas relacionados en comparación con otros. La traducción simultánea del mismo mensajero por medio de un gran número de ribosomas incrementa en grado notorio la tasa de síntesis de proteínas dentro de la célula. Estudios recientes con tomografía crioelectrónica (sección 18.2) sugirieron que la disposición tridimensional y la orientación de los ribosomas dentro de un polisoma “libre” (p. ej., no unido a una membrana) son bastante ordenados. La figura 11.52b muestra un modelo de un polisoma generado con esta técnica. Los ribosomas que conforman este polisoma modelo están en un conjunto denso y adoptaron una disposición en “doble fila”. Además, cada uno de los ribosomas individuales se orienta de tal manera que su polipéptido naciente (filamentos rojos o verdes) se sitúe en su superficie externa, apuntando hacia el citosol. Se sugiere que esta orientación maximiza la distancia entre las cadenas nacientes, lo que disminuye la probabilidad de que éstas interactúen entre sí y tal vez se agreguen. La figura 11.52c muestra una micrografía electrónica de polisomas unidos a la superficie citosólica de la membrana del retículo endoplásmico. Se presume que estos polirribosomas participaban en la síntesis de las proteínas de la membrana y/o de algún organelo en el momento en el que se fijó la célula (pág. 282). Los ribosomas de cada polisoma parecen organizarse en la superficie de la membrana del ER en un asa circular o en una espiral.
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Ahora que se han descrito los sucesos básicos de la traducción es necesario cerrar el capítulo con imágenes del proceso, tomadas de una célula procariota (fig. 11.53a) y otra eucariota (fig. 11.53b). A diferencia de las células con organelos membranosos, en las que la transcripción tiene lugar en el núcleo y la traducción en el citoplasma a través de diferentes pasos, las actividades correspondientes en células procariotas están acopladas de manera estrecha. Por lo tanto, la síntesis de proteínas en células bacterianas comienza en plantillas de mRNA antes de que la síntesis de éste concluya. La producción de un mensajero procede en la misma dirección que la traducción por parte de los ribosomas, es decir, avanza del extremo 5′ al 3′. En consecuencia, tan pronto como una molécula de RNA ha comenzado a sintetizarse, el extremo 5′ está disponible para la unión de los ribosomas. La micrografía de la figura 11.53a muestra un DNA siendo transcrito, moléculas de mRNA en proceso de síntesis y los ribosomas que traducen a cada una de ellas. Las cadenas de proteínas producidas no se observan en la micrografía de la figura 11.53a, pero son visibles en la imagen de la figura 11.53b, que muestra un solo polirribosoma aislado de una célula glandular de un gusano de seda. La proteína de seda que se está sintetizando es visible por su gran tamaño y naturaleza fibrosa. El desarrollo de técnicas para visualizar la transcripción y la traducción, obra de Oscar Miller Jr., ha posibilitado una demostración visual del proceso que se describió con anterioridad en términos bioquímicos.
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REVISIÓN
Descríbanse algunas diferencias entre el paso de iniciación y los pasos de la elongación durante la traducción.
¿De qué manera difiere el efecto de una mutación no codificante del de una mutación con cambio del marco de lectura?, ¿por qué?
¿Qué es un polirribosoma?, ¿cómo cambia su formación en procariotas y en eucariotas?
Durante la elongación de la traducción, se puede afirmar que un aminoacil-tRNA entra al sitio A, un peptidil-tRNA al sitio P y un tRNA desacilado al sitio E. Explique cómo ocurre cada uno de estos sucesos.
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VÍAS EXPERIMENTALES Función del RNA como catalizador
Investigaciones en bioquímica y biología molecular durante el decenio de 1970 consolidaron los conocimientos acerca de la función de las proteínas y los ácidos nucleicos. Las primeras son los agentes que activan los procesos de la célula y las enzimas aceleran la velocidad de las reacciones químicas dentro de los organismos. Por otra parte, los ácidos nucleicos son moléculas encargadas de la información en la célula y almacenan instrucciones genéticas en sus secuencias nucleotídicas. La división del trabajo entre proteínas y ácidos nucleicos parecía estar bien definida, como cualquier distinción establecida en las ciencias biológicas. Entonces, en 1981, se publicó un trabajo que cambió dicha ideología.1
Thomas Cech y colaboradores, de la University of Colorado, habían estudiado el proceso mediante el cual el precursor del RNA ribosómico sintetizado por el protozoario ciliado Tetrahymena thermophila se convertía en moléculas de rRNA maduras. El pre-rRNA de T. thermophila contiene un intrón de casi 400 nucleótidos que deben eliminarse del transcrito primario antes de que se unan (liguen) los exones.
Antes, Cech había observado que núcleos aislados de las células podían sintetizar el pre-rRNA y efectuar la reacción de corte y empalme en su totalidad. Todavía no se aislaban empalmosomas de ningún tipo celular y parecía que Tetrahymena podía ser un buen sistema para estudiar dichas enzimas. El primer paso fue aislar el precursor de pre-rRNA en un estado intacto y luego determinar el número mínimo de componentes nucleares que debían agregarse a la mezcla para obtener un corte y empalme precisos. Se observó que al incubar núcleos aislados en un medio con cationes monovalentes en baja concentración (5 mM de NH4+), se sintetizaba la molécula de pre-rRNA pero el intrón no se escindía. Esto permitió a los investigadores purificar el precursor intacto, que planeaban utilizar como sustrato para analizar la actividad de corte y empalme en extractos nucleares. Sin embargo, observaron que al incubar el precursor purificado por sí solo en concentraciones más elevadas de NH4+ en presencia de Mg2+ y fosfato de guanosina (p. ej., GMP o GTP), el intrón se eliminaba del precursor (fig. 1).1 El análisis de la secuencia nucleotídica confirmó que el RNA pequeño separado del precursor era el intrón con un nucleótido añadido que contenía guanina en el extremo 5′. Se demostró que el nucleótido adicional derivaba del GTP agregado a la mezcla de reacción.
El corte y empalme de un intrón es una reacción compleja que requiere el reconocimiento de las secuencias que limitan al intrón, la rotura de los enlaces fosfodiéster en ambos extremos de éste y la unión de los fragmentos adyacentes. Se habían efectuado todo tipo de esfuerzos para eliminar cualquier proteína que pudiera adherirse al RNA antes de probar su capacidad para realizar el corte y empalme. El RNA se había extraído por medio de detergente y fenol, centrifugado a través de un gradiente y tratado con una enzima proteolítica. Sólo hubo dos explicaciones razonables: el mecanismo de corte y empalme lo efectuaba una proteína unida con firmeza al RNA o la molécula de pre-rRNA era capaz de experimentar corte y empalme por sí misma. Esta última idea no era fácil de aceptar.
Para resolver el problema de la presencia de una proteína contaminante, Cech y col. recurrieron a un sistema artificial que no tenía la posibilidad de contener proteínas nucleares de corte y empalme.2 El DNA que codifica al precursor de rRNA se sintetizó en E. coli, se purificó y se utilizó como plantilla para su transcripción in vitro a través de una RNA polimerasa bacteriana purificada. El pre-rRNA sintetizado in vitro se depuró e incubó en presencia de iones monovalentes y divalentes y un compuesto de guanosina. Puesto que el RNA nunca había estado en una célula, era imposible que estuviera contaminado por enzimas celulares de corte y empalme. Aun así, el pre-rRNA aislado experimentó corte y empalme tal y como había ocurrido en la célula. El RNA tenía que realizar este proceso por sí solo.
Como resultado de estos experimentos, el RNA mostró ser capaz de catalizar una reacción compleja de múltiples pasos. Los cálculos indicaron que este proceso había ocurrido a una velocidad casi 10 000 millones de veces mayor que la reacción no catalizada. Por lo tanto, al igual que las enzimas proteínicas, el RNA era activo en bajas concentraciones, no se alteraba por el proceso y podía acelerar de modo considerable una reacción química. La principal diferencia entre este RNA y las “enzimas proteínicas estándar” fue que el RNA actuaba sobre sí mismo en lugar de hacerlo sobre un sustrato independiente. Cech denominó a este RNA “ribozima”.
En 1983 se descubrió un segundo ejemplo de catálisis mediada por RNA.3 Sidney Altman, de la Yale University, y Norman Pace del National Jewish Hospital en Denver, eran colaboradores en el estudio de la ribonucleasa P, una enzima que interviene en el procesamiento de un precursor de RNA de transferencia en bacterias. La enzima era poco común dado que se componía de proteínas y RNA. Cuando se incubó en amortiguadores con una concentración elevada de Mg2+ (60 mM), la subunidad de RNA purificada pudo eliminar el extremo 5′ del precursor de tRNA (carril 7 de la fig. 2), del mismo modo que la molécula íntegra de la ribonucleasa P lo haría dentro de la célula. Los productos de la reacción in vitro incluyeron la molécula de tRNA madura procesada. Por el contrario, el extracto de la subunidad proteínica de la enzima no tenía actividad catalítica (carril 5 de la fig. 2).
Para eliminar la posibilidad de que una proteína contaminante fuera en verdad la que catalizaba la reacción, se sintetizó in vitro la porción de RNA de la ribonucleasa P a partir de una plantilla de DNA recombinante. Tal y como se observó con el RNA extraído de las células bacterianas, este RNA sintetizado de forma artificial, sin proteína alguna añadida, pudo cortar con precisión al precursor de tRNA.4 A diferencia de la enzima procesadora de rRNA estudiada por Cech, el RNA de la ribonucleasa P actúa sobre otra molécula como sustrato y no sobre sí misma. Por lo tanto, se demostró que las ribozimas pueden tener las mismas propiedades catalíticas que las enzimas proteínicas. En la figura 3 se muestra un modelo de la interacción entre la subunidad catalítica de RNA de la ribonucleasa P y un sustrato de precursor de tRNA.
La demostración de que el RNA podía catalizar reacciones químicas suscitó una atmósfera apropiada para reformular una pregunta añeja: ¿qué componente de la subunidad ribosómica grande es la transferasa de peptidilo, es decir, el catalizador de la formación de los enlaces peptídicos? Durante la década de 1970, diferentes hallazgos independientes plantearon la posibilidad de que el RNA ribosómico podía actuar de diversas formas y no sólo funcionar como andamiaje para mantener a las proteínas ribosómicas en la posición adecuada para catalizar la traducción. Entre los hallazgos se incluyeron los siguientes datos:
Ciertas cepas de E. coli portan genes que codifican proteínas que destruyen bacterias, conocidas como colicinas. Se sabe que una de estas toxinas, la colicina E3, inhibe la síntesis de proteínas en células bacterianas sensibles. Los ribosomas aislados de células tratadas con colicina E3 parecen del todo normales, de acuerdo con la mayor parte de los criterios, pero no son capaces de sintetizar proteínas in vitro. Un análisis más detallado de estos organelos reveló que el defecto residía en el rRNA, no en las proteínas ribosómicas. La colicina divide el RNA 16S de la subunidad pequeña en casi 50 nucleótidos desde su extremo 3′, lo cual incapacita a la subunidad completa para producir proteínas.5
El tratamiento de las subunidades ribosómicas grandes con ribonucleasa T1, una enzima que corta las uniones entre los nucleótidos accesibles del RNA, destruye la capacidad de la subunidad para efectuar la reacción de la transferasa de peptidilo.6
Una gran variedad de estudios con antibióticos que inhiben la formación de enlaces peptídicos, incluidos el cloranfenicol, la carbomicina y la eritromicina, sugieren que estos fármacos actúan sobre el RNA ribosómico y no sobre las proteínas. Por ejemplo, se encontró que los ribosomas se vuelven resistentes a los efectos del cloranfenicol como resultado de sustituciones en las bases del RNA ribosómico.7
Se ha demostrado que los RNA ribosómicos tienen secuencias de bases muy conservadas, mucho más que los ordenamientos de aminoácidos de las proteínas que integran dichos organelos. Algunas de las regiones de los RNA ribosómicos virtualmente no cambian en ribosomas aislados de procariotas, plantas y animales, al igual que en ribosomas obtenidos de mitocondrias y cloroplastos. El hecho de que las secuencias de los rRNA estén muy conservadas sugiere que dichas moléculas tienen una participación crucial en la función del ribosoma.8,9 De hecho, en una publicación de 1975, C. R. Woese y col., señalaron lo siguiente: “puesto que la correlación entre estas regiones conservadas y los sitios conocidos de unión de proteínas ribosómicas es escasa o no existe, hay una fuerte implicación de que grandes regiones del RNA participen de forma directa en la función ribosómica”.8
Después del descubrimiento de RNA catalíticos en los laboratorios de Cech y Altman, se intensificó la investigación sobre las funciones de los RNA ribosómicos. Algunos estudios que llevaron a cabo Harry Noller y col., de la University of California, en Santa Cruz, destacaron el sitio del RNA ribosómico que reside sobre el centro de la transferasa de peptidilo, o bien alrededor de él.9 En un estudio se mostró que RNA de transferencia unidos al ribosoma protegen a bases específicas en el rRNA de la subunidad grande del ataque de agentes químicos específicos. Esta protección es evidencia de que el tRNA debe estar situado muy cerca de las bases del rRNA que se encuentran protegidas.10 La defensa se pierde si el extremo 3′ del tRNA (el extremo con el CCA unido al aminoácido) se elimina. Éste es el extremo del tRNA que participa en la formación del enlace peptídico, el cual cabría esperar que residiera muy cerca del sitio de la transferasa de peptidilo.
Intentos por asignar una función particular a RNA ribosómicos aislados han fallado. Se creía que incluso si éstos tuvieran funciones específicas, la presencia de proteínas ribosómicas era por lo menos necesaria para mantener a los rRNA en su conformación apropiada. Al considerar que las proteínas y los rRNA ribosómicos evolucionaron de forma conjunta durante miles de millones de años, sería de esperar que los dos tipos de moléculas dependieran uno del otro. A pesar de esta expectativa, en 1992 Noller y colaboradores demostraron por fin la capacidad catalítica de rRNA aislado.11 Al trabajar con ribosomas en particular estables de Thermus aquaticus, una bacteria que vive a temperaturas elevadas, Noller trató preparaciones de la subunidad ribosómica grande con un detergente extractor de proteínas (SDS, dodecilsulfato de sodio), una enzima que degrada proteínas (proteinasa K) y varios lavados con fenol, un desnaturalizante de proteínas. Juntos, estos agentes removieron al menos 95% de las proteínas de las subunidades ribosómicas y se conservó el rRNA. Casi 5% de las proteínas vinculadas con el rRNA consistía en pequeños fragmentos de proteínas ribosómicas. A pesar de la eliminación de casi todos los componentes polipeptídicos, el rRNA retuvo 80% de la actividad de transferasa de peptidilo en comparación con la subunidad intacta. El cloranfenicol y el tratamiento con ribonucleasa bloquearon la actividad catalítica. Cuando el RNA se sometió a tratamientos adicionales para remover la cantidad pequeña de proteínas remanentes, la preparación perdió su actividad catalítica. Puesto que es muy poco probable que las proteínas remanentes tengan alguna actividad catalítica de importancia, se presume por estos experimentos que la transferasa de peptidilo es una ribozima.
La confirmación final de esta conclusión requirió los resultados de estudios realizados con cristalografía por rayos X. Como se esperaría por la complejidad de las subunidades ribosómicas, obtener cristales de alta calidad de las partículas mencionadas fue una tarea muy difícil. Los mejores resultados en este terreno los obtuvieron Ada Yonath y colaboradores del Weizmann Institute de Israel, que recurrieron al uso de ribosomas de extremófilas procariotas (pág. 14) que vivían en aguas a alta temperatura o con gran salinidad. Los esfuerzos para el análisis cristalográfico de subunidades ribosómicas culminó con la publicación, en el año 2000, de estructuras cristalinas de alta resolución de (1) la subunidad ribosómica grande de Haloarcula marismortui, una arquebacteria que vive en el Mar Muerto (trabajo de Thomas Steitz, Peter Moore y colaboradores, de la Universidad de Yale)12 y (2) la subunidad 30S de la bacteria termófila Thermus thermophilus (por parte de Venkatraman Ramakrishnan y colaboradores, de la Cambridge University13 y de Ada Yonath y col., en Alemania e Israel).14 En la página 426 se muestra un modelo de la subunidad 50S. Para identificar el sitio de la transferasa de peptidilo dentro de la subunidad ribosómica grande, Steitz y colaboradores sometieron los cristales de estas subunidades a la acción de CCdA-puromicina-fosfato, una sustancia que inhibe la formación de enlaces peptídicos al unirse con fuerza al sitio activo de la transferasa de peptidilo. La determinación de la estructura de estas subunidades con una resolución atómica reveló la localización del inhibidor de unión y de esa forma la ubicación del sitio de la transferasa de peptidilo.15 En este estudio se encontró que el sitio activo del inhibidor se une dentro de una hendidura de la subunidad que está rodeada en su totalidad por residuos nucleotídicos conservados del rRNA 23S. De hecho, no existe ninguna cadena lateral de aminoácidos de ninguna de las proteínas ribosómicas en un diámetro de ~18 Å a partir del sitio donde se sintetiza un enlace peptídico. Esto apoya de manera relevante la conclusión de que el ribosoma es una ribozima (algunos estudios cristalográficos sobre ribosomas eucariotas se discuten en los artículos referenciados 16 y 17. El mecanismo de acción del rRNA 23S en la formación de enlaces peptídicos se revisa en el artículo número 18).
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