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Los microscopios son instrumentos que producen una imagen aumentada de un objeto. La figura 18.1 muestra los componentes principales de un microscopio óptico compuesto. Una fuente de luz, que puede ser externa al microscopio o estar incluida en su base, ilumina la muestra. La lente condensadora subyacente reúne los rayos difusos de la fuente de luz e ilumina la muestra con un pequeño cono de luz brillante que permite ver las partes muy pequeñas de éste después de la magnificación. Los rayos de luz enfocados en la muestra por la lente condensadora se reciben en la lente del objetivo del microscopio. A partir de este punto es necesario considerar dos conjuntos de rayos lumínicos que entran a la lente del objetivo: los que ya alteró la muestra y los que no modificó (fig. 18.2). Este último grupo se refiere a la luz proveniente del condensador que pasa en forma directa a la lente del objetivo y constituye la luz de fondo del campo visual. El primer grupo de rayos de luz surge de las múltiples partes de la muestra y forma la imagen del mismo. La lente del objetivo enfoca estos rayos de luz para formar una imagen real y magnificada del objeto dentro de la columna del microscopio (fig. 18.1). Un segundo sistema de lentes, la lente del ocular, emplea la imagen formada por la lente del objetivo como objeto para formar una imagen virtual y aumentada. Un tercer sistema de lentes localizado en la parte frontal del ojo utiliza la imagen virtual producida por la lente del ocular como objetivo para producir una imagen real en la retina. Cuando el tornillo de enfoque del microscopio de luz se gira, la distancia relativa entre la muestra y la lente del objetivo cambia, lo que permite que la imagen final se enfoque con exactitud en el plano de la retina. La magnificación total obtenida por el microscopio es el producto de las magnificaciones logradas por la lente del objetivo y la lente del ocular.
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Hasta este punto sólo se consideró la magnificación de un objeto sin prestar atención a la calidad de la imagen producida, o sea, el nivel al cual los detalles de la muestra se conservan en la imagen. Supóngase que se mira una estructura en el microscopio con una lente del objetivo relativamente potente (p. ej., 63×) y una lente ocular que amplifica la imagen del objetivo cinco veces más (un ocular 5×). Asúmase que el campo está compuesto por cromosomas y es importante identificar el número que hay, pero algunos están muy cerca unos de los otros y no pueden distinguirse como estructuras separadas (fig. 18.3a). Una solución podría ser cambiar los oculares para incrementar el tamaño de los objetos que se observan. Si se cambiara de un ocular 5× a uno 10×, lo más probable es que la capacidad para contar el número de cromosomas aumentara (fig. 18.3b) porque ahora la imagen de los cromosomas producida por la lente del objetivo se extiende sobre una parte más grande de la retina. Mientras más fotorreceptores proporcionen información respecto a la imagen, más detalles pueden verse (fig. 18.4). Sin embargo, si se cambia a un ocular 20×, no es probable que se perciban más detalles aunque la imagen sea más grande (fig. 18.3c), es decir, que ocupe más superficie retiniana. El cambio de ocular no proporciona más información porque la imagen producida por el objetivo no tiene más detalles que aumentar con el mayor poder del ocular. El segundo cambio en el ocular sólo brinda magnificación vacía (como en la fig. 18.3c).
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La calidad óptica de una lente del objetivo se mide por la extensión en la que pueden discriminarse, o resolverse, los detalles finos de una muestra. La difracción limita la resolución que se obtiene con un microscopio. A causa de la difracción, la luz que emana de un punto de la muestra nunca puede verse como un punto en la imagen, sino sólo como un pequeño disco. Si los discos producidos por dos puntos cercanos se superponen, los puntos no pueden distinguirse en la imagen. Por lo tanto, el poder de resolución de un microscopio puede definirse en términos de la capacidad para ver dos puntos vecinos en el campo visual como dos entidades distintas; dicho poder de resolución está limitado por la longitud de onda de la iluminación de acuerdo con la ecuación
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donde d es la distancia mínima que debe separar dos puntos en la muestra para resolverse, lambda (λ) es la longitud de onda de la luz (527 nm para la luz blanca) y n es el índice refractivo del medio presente entre la muestra y la lente del objetivo. Alfa (α) es igual a la mitad del ángulo del cono de luz que entra a la lente del objetivo, como se muestra en la figura 18.2. Alfa es una medida de la capacidad de reunión de luz de la lente y mantiene una relación directa con su abertura.
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El denominador de la ecuación en la columna 1 se conoce como abertura numérica (N. A., numerical aperture). Esta última es una constante para cada lente, una medida de sus cualidades para reunir luz. La N.A. máxima posible para un objetivo que se diseña para usarlo en el aire es 1.0 porque el seno del máximo ángulo posible de α, 90°, es 1, y el índice refractivo del aire es 1.0. Para un objetivo diseñado para sumergirse en aceite, la N.A. máxima posible se acerca a 1.5. Como regla general práctica, la máxima magnificación útil de un microscopio óptico varía entre 500 y 1 000 veces la abertura numérica del lente del objetivo que se use. Los intentos para aumentar la imagen después de este punto producen magnificación vacía y la calidad de la imagen se deteriora. Una abertura numérica alta se logra con lentes que tienen una distancia focal corta, lo que permite colocar la lente muy cerca de la muestra.
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El límite de resolución del microscopio óptico se establece si se sustituye la longitud de onda mínima posible de iluminación y la mayor abertura numérica posible en la ecuación previa. Cuando se realizan tales sustituciones, se obtiene un valor un poco menor de 0.2 μm (o 200 nm), que es suficiente para observar organelos celulares grandes, como los núcleos y las mitocondrias. En cambio, el límite de resolución del ojo desnudo, que tiene una abertura numérica cercana a 0.004, se aproxima a 0.1 mm.
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Además de estos factores teóricos, el poder de resolución también depende de los defectos ópticos, o aberraciones. Existen siete aberraciones ópticas importantes y constituyen las limitaciones que los fabricantes de lentes deben vencer para producir lentes del objetivo cuyo poder de resolución real se aproxime a los límites teóricos. El objetivo está hecho con una serie compleja de lentes, en lugar de una sola lente convergente, a fin de eliminar estas aberraciones. Por lo general una unidad de lente proporciona la magnificación requerida, en tanto que las demás compensan los errores de la primera para brindar una imagen general corregida.
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En el lado más práctico de la microscopia en relación con los límites de la resolución se encuentra el tema de la visibilidad, que se refiere a los factores que en realidad permiten observar un objeto. Esto podría parecer un asunto trivial; si el objeto está ahí, puede verse. Considérese el caso de una cuenta de vidrio transparente. Bajo la mayor parte de las condiciones, contra casi todos los fondos, la cuenta se ve con claridad. Sin embargo, si una cuenta de vidrio se deja caer en un recipiente con aceite de inmersión con el mismo índice refractivo que el vidrio, la cuenta desaparece de la vista porque ya no afecta la luz de ninguna manera obvia que sea distinta al líquido de fondo. Cualquiera que haya pasado tiempo buscando una amiba puede apreciar el problema de la visibilidad con el microscopio óptico.
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Lo que se ve a través de una ventana o por un microscopio son los objetos que afectan la luz de manera distinta al fondo. Otro término para la visibilidad en este sentido de la palabra es el contraste, o la diferencia en la apariencia entre las partes adyacentes de un objeto o entre un objeto y su fondo. La necesidad del contraste puede apreciarse si se consideran las estrellas. En tanto que el cielo claro de la noche puede estar lleno de estrellas, el mismo cielo durante el día parece carente de cuerpos celestes. Las estrellas desaparecieron de la vista, pero no del cielo. Ya no son visibles contra el fondo mucho más brillante.
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En el mundo macroscópico, para examinar objetos se hace caer la luz sobre ellos y luego se observa la luz que se refleja a los ojos del observador. En cambio, cuando se utiliza un microscopio la muestra se coloca entre la fuente de luz y los ojos, y se ve la luz que se transmite a través del objeto (o en términos más apropiados, la que difracta el objeto). Si una persona toma un objeto, entra a una habitación con una fuente de luz y sujeta el objeto entre la fuente de luz y los ojos, puede apreciarse parte de la dificultad con tal iluminación; es necesario que el objeto que se examina sea casi transparente, o sea, translúcido. Aquí radica otro aspecto del problema: puede ser difícil observar objetos que son “casi transparentes”.
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Una de las mejores formas para hacer que una muestra delgada y traslúcida sea visible al microscopio es teñirla con algún colorante, que absorba sólo ciertas longitudes de onda del espectro visible. Las longitudes de onda que no se absorben se transmiten al ojo, lo que hace que el objeto teñido parezca coloreado. Los distintos colorantes se unen a diferentes tipos de moléculas biológicas, por lo que estos procedimientos no sólo incrementan la visibilidad de la muestra, también indican en qué puntos de la célula o tejido se encuentran los distintos tipos de sustancias. Un buen ejemplo es la tinción de Feulgen, que es específica para el DNA; hace que los cromosomas se vean coloreados al microscopio (fig. 18.5). Un problema de los colorantes es que por lo común no se pueden usar en células vivas pues por lo regular son tóxicos, o lo es el entorno de tinción, o los colorantes no penetran la membrana plasmática. Por ejemplo, la tinción de Feulgen requiere la hidrólisis del tejido en ácido antes de aplicar el pigmento.
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Los diferentes tipos de microscopios ópticos usan distintos tipos de iluminación. En un microscopio de campo brillante (claro) el cono de luz que ilumina la muestra se observa como fondo brillante contra el que la imagen de la muestra debe contrastarse. La microscopia de campo brillante es ideal para las muestras de alto contraste, como los cortes teñidos de tejidos, pero es probable que no se obtenga la visibilidad óptima para otros especímenes. En las secciones siguientes se consideran varios medios alternativos para hacer que las muestras sean más visibles en un microscopio óptico.
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Preparación de muestras para microscopia de luz de campo claro
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Las muestras a observar en el microscopio óptico se dividen en dos categorías amplias: monturas completas y cortes. Una montura completa es un objeto intacto, ya sea vivo o muerto, y puede consistir en un microorganismo entero como un protozoario o en una pequeña parte de un organismo más grande. La mayor parte de los tejidos de plantas y animales son demasiado opacos para su análisis microscópico, a menos que éstos se examinen como una rebanada muy delgada, o corte. Para preparar un corte, primero se matan las células mediante inmersión del tejido en alguna solución química llamada fijador. Un buen fijador penetra rápido en la membrana celular e inmoviliza todo su material macromolecular, de modo que la estructura de la célula se mantiene lo más similar posible a la de la célula viva. Los fijadores más usuales para la microscopia óptica son soluciones de formaldehído, alcohol o ácido acético.
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Tras la fijación, el tejido se deshidrata por transferencia a través de una serie de alcoholes y luego se impregna con parafina (cera), lo que brinda soporte mecánico durante el proceso de corte. La parafina se utiliza como medio de impregnación porque se disuelve de manera fácil con solventes orgánicos. Las laminillas que contienen cortes adherentes de parafina se sumergen en tolueno, que disuelve la cera y deja una rebanada delgada de tejido unido a la laminilla, donde puede teñirse o tratarse con enzimas, anticuerpos u otros agentes. Después de la tinción se coloca un cubreobjetos sobre el tejido con un medio de montaje que tenga el mismo índice refractivo que el portaobjetos y el cubreobjetos.
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Microscopia de contraste de fase
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Las muestras pequeñas y no teñidas, como una célula viva, pueden ser difíciles de observar con un microscopio de campo brillante (fig. 18.6a). El microscopio de contraste de fase hace más visibles los objetos muy transparentes (fig. 18.6b). Pueden distinguirse diferentes partes de un objeto porque cada uno de ellos afecta la luz de manera distinta. Una base de estas diferencias es el índice refractivo. Los organelos celulares están constituidos por distintas proporciones de varias moléculas: DNA, RNA, proteínas, lípidos, carbohidratos, sales y agua. Es probable que las regiones con composición diferente tengan índices de refracción distintos. En condiciones normales el ojo humano no puede detectar tales diferencias. Sin embargo, el microscopio de contraste de fase convierte las diferencias del índice de refracción en diferencias de intensidad (brillantez y oscuridad relativas) que son visibles para el ojo humano. Los microscopios de contraste de fase logran esto: (1) mediante la separación de la luz directa que entra a la lente del objetivo desde la luz difractada que proviene de la muestra y (2) al hacer que los rayos de luz de estas dos fuentes interfieran unos con los otros. La brillantez u oscuridad relativas de cada parte de la imagen reflejan la forma en que la luz de esa parte de la muestra interfiere con la luz directa.
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Los microscopios de contraste de fase son más útiles para examinar componentes intracelulares de células vivas con una resolución hasta cierto punto alta. Por ejemplo, la movilidad dinámica de las mitocondrias, los cromosomas mitóticos y las vacuolas pueden seguirse y filmarse con este sistema óptico. La mera observación del modo en que las diminutas partículas y vacuolas de las células se mueven de un lado a otro al azar dentro de una célula viva causa una emoción respecto a la vida, que no puede obtenerse si se observan células muertas y teñidas. El mayor beneficio aportado por la invención del microscopio de contraste de fase no fue el descubrimiento de nuevas estructuras, sino su empleo diario en laboratorios de investigación y enseñanza para observar células de manera más reveladora.
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El microscopio de contraste de fase tiene limitaciones ópticas que producen pérdida de resolución y la imagen se afecta por halos que interfieren y sombras producidas en sitios donde el índice refractivo experimenta cambios súbitos; es un tipo de microscopio de interferencia. Otros tipos de microscopios de interferencia minimizan estos artefactos ópticos al lograr una separación completa de los rayos directos y difractados por medio del uso de trayectos complejos de luz y prismas. Otro tipo de sistema de interferencia, llamado contraste de interferencia diferencial (DIC), o a veces interferencia de Nomarski en honor de su desarrollador, presenta una imagen que tiene una calidad tridimensional aparente (fig. 18.6c). El contraste en la microscopia DIC depende de la velocidad de cambio del índice refractivo en la muestra. En consecuencia los bordes de las estructuras, donde el índice refractivo varía mucho en una distancia más o menos corta, se observan con bastante contraste.
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Microscopia de fluorescencia (y técnicas relacionadas basadas en la fluorescencia)
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En los dos últimos decenios, el microscopio óptico se ha transformado de un instrumento diseñado principalmente para examinar cortes de tejidos fijos, a un instrumento capaz de mostrar los sucesos dinámicos que ocurren a nivel molecular en las células vivas. En gran medida, estos avances en la visualización de células vivas han sido posibles gracias a innovaciones en la microscopia de fluorescencia. Esta última permite observar la localización de determinados compuestos (llamados fluorocromos o fluoróforos) que absorben radiación ultravioleta invisible y emiten porciones de la energía en las longitudes de onda visibles, más largas, un fenómeno que se conoce como fluorescencia. La fuente de luz en un microscopio de este tipo produce un rayo de luz ultravioleta que viaja por un filtro, el cual bloquea todas las longitudes de onda excepto la que puede excitar el fluorocromo. El rayo de luz monocromática se enfoca en la muestra que contiene el fluorocromo, que se excita y emite luz de longitud de onda visible para el observador. Como la fuente de luz produce sólo luz ultravioleta (negra), los objetos teñidos con un fluorocromo parecen tener un color brillante contra un fondo negro, lo que brinda un gran contraste.
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En biología celular y molecular existen diversas formas de utilizar los compuestos fluorescentes. En una de sus aplicaciones más usuales, un fluorocromo (como la rodamina o la fluoresceína) se une en forma covalente (conjugada) con un anticuerpo para producir un anticuerpo fluorescente que puede emplearse para localizar una proteína específica dentro de la célula. Esta técnica se denomina inmunofluorescencia y se ilustra en la micrografía de la figura 9-30a. La inmunofluorescencia se describe mejor en la página 783. Las proteínas con marca fluorescente también pueden usarse para estudiar procesos dinámicos mientras ocurren en una célula viva. Por ejemplo, un fluorocromo específico puede unirse con una proteína celular, como la actina o la tubulina, y la proteína con marca fluorescente se inyecta en una célula viva (figs. 9.4 y 9-73b). Los fluoróforos también se utilizan para situar moléculas de DNA o RNA que contienen secuencias específicas de nucleótidos, como se describen en la página 402 y se ilustran en la figura 10.19. En otros ejemplos, los fluoróforos se han usado para estudiar el tamaño de las moléculas que pasan entre las células (ver fig. 7.33), como indicadores de potenciales transmembranarios (ver fig. 5.21), o como sondas para conocer la concentración de calcio libre en el citosol (ver fig. 15-29). El empleo de los fluoróforos sensibles al calcio se expone en la página 649.
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En todos los ejemplos señalados en el párrafo anterior, las biomoléculas se tornaron fluorescentes al conjugarlas con un fluoróforo orgánico sintético; sin embargo, también se cuenta con moléculas fluorescentes naturales. Los humanos desde hace miles de años se han preguntado porqué las medusas y otros animales marinos emiten luz en la oscuridad. Fue apenas en el comienzo en el decenio de 1960 cuando Osamu Shimomura descubrió que algunas especies de dichos organismos (Aequorea victoria) emiten luminosidad por la presencia de proteínas fluorescentes como la aequorina y la proteína fluorescente verde (GFP; green fluorescent protein), y las pudo purificar y analizar. En los comienzos del decenio de 1990, Douglas Prasher, Martin Chalfie y colaboradores clonaron el gen que codifica GFP y demostraron que la proteína fluorescente podría ser incorporada genéticamente y expresada en otros organismos. El estudio en cuestión preparó el terreno para utilizar GFP para investigar la distribución espacial y temporal de las proteínas en células vivas. A diferencia de la mayor parte de las otras proteínas fluorescentes, GFP no requiere un cofactor adicional para absorber y emitir luz; en lugar de eso, se forma un cromóforo absorbente/emisor de luz por modificación autónoma (o sea, por una reacción catalítica) de tres de los aminoácidos que conforman la estructura primaria del polipéptido GFP. En la mayoría de los estudios que usan GFP, se construye un DNA recombinante en el que la región codificadora del gen GFP está unida con la región codificadora del gen para la proteína en estudio. Este DNA recombinante se utiliza para transfectar a las células, que luego sintetizan una proteína quimérica que contiene GFP fluorescente fusionada con la proteína en estudio. El uso de GFP para estudiar la dinámica de la membrana se describe en la página 273. En estos diversos protocolos experimentales, las proteínas marcadas participan en las actividades normales de la célula y su localización puede seguirse al microscopio para revelar las actividades dinámicas en las que la proteína participa (ver figs. 8.4 y 9.2).
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Los estudios imagenológicos en células vivas a menudo aportan mayor información gracias al uso simultáneo de variantes de GFP que presentan diferentes propiedades espectrales. Las variantes de GFP que florecen con tonos de azul (BFP), amarillo (YFP) y azul verdoso (ciano) (CFP) fueron generadas por Roger Tsien en la Universidad de California, San Diego, gracias a la mutagénesis dirigida del gen GFP. Además de la anémona de mar se aisló una proteína tetramérica de fluorescencia roja (DsRed) no emparentada directamente. También se han generado en el laboratorio de Tsien, variantes monoméricas de DsRed (p. ej., mBanana, mTangerine, y mOrange), que fluorescen y emiten colores perfectamente identificables, gracias a experimentos de mutagénesis dirigida. El tipo de información que puede obtenerse con esta “paleta” de variantes de GFP se ilustra en la figura 18.7, en el que los investigadores generaron cepas de ratones cuyas neuronas contenían proteínas fluorescentes de colores distintos. Cuando un músculo de uno de estos ratones se expuso por medios quirúrgicos, los investigadores observaron las interacciones dinámicas entre las neuronas de diversos colores y las uniones neuromusculares inervadas (ver fig. 4.56 que presenta un dibujo de este tipo de unión). Por ejemplo, observaron cómo las ramas de una neurona coloreada con CFP competían con las ramas de una neurona coloreada con YFP por establecer contacto sináptico con el tejido muscular. En cada caso encontraron que cuando dos neuronas compiten por la inervación de diferentes fibras musculares, todas las ramas “ganadoras” pertenecen a una de las neuronas, en tanto que todas las ramas “perdedoras” pertenecen a la otra neurona (fig. 18.7b). Las micrografías presentadas al inicio del capítulo constituyen otro ejemplo de lo mucho que se puede aprender sobre la dinámica espacial y temporal de fenómenos celulares por el uso de dos o más proteínas fluorescentes espectralmente diferentes. En esta situación, la estrategia de dos “marcadores” permitió a los investigadores vigilar los movimientos simultáneos de dos proteínas en tiempo real, tal como acaece dentro de los confines de un organelo celular particular. Otro ejemplo se describe en la “Vía experimental” del capítulo 8 (pág. 321).
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Las variantes de GFP también son útiles en una técnica llamada transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET), que se emplea para medir cambios en la distancia entre dos partes de una proteína (o entre dos proteínas separadas dentro de una estructura más grande). La técnica de FRET puede usarse para estudiar estos cambios mientras ocurren in vitro o dentro de una célula viva. Esta técnica se basa en el hecho de que la energía de excitación puede transferirse de un grupo fluorescente (un donador) a otro grupo fluorescente (un receptor), siempre y cuando ambos grupos estén muy próximos (1 a 10 nm). Dicha transferencia de energía reduce la intensidad de la fluorescencia del donador e incrementa la intensidad de fluorescencia del receptor. La eficiencia de la transferencia entre dos grupos fluorescentes unidos a sitios estratégicos de una proteína disminuye mucho cuando la distancia entre los dos grupos aumenta. Como resultado la determinación de los cambios en la fluorescencia de los grupos donador y receptor que se producen durante algún proceso brinda una medida de los cambios en la distancia entre ellos en las distintas etapas del proceso. Esta técnica se ilustra en la figura 18.8, en la que dos variantes de GFP (marcadas ECFP y EYFP) se unieron en forma covalente con dos partes distintas de una proteína cinasa dependiente de cGMP (PKG). En ausencia de un cGMP unido, los dos fluorocromos están demasiado separados para que haya transferencia de energía. La unión de cGMP induce un cambio en la conformación de la proteína que aproxima los dos fluorocromos lo suficiente para que la FRET ocurra. La FRET también puede emplearse para seguir procesos como el plegamiento de una proteína o la asociación y disociación de los componentes dentro de una membrana. La separación de las colas citoplásmicas de subunidades de integrina después de la activación por talina (fig. 7.14) es un ejemplo de un suceso que se ha estudiado por FRET. La figura 15.8 señala un ejemplo temprano en el que la técnica de FRET se utilizó para identificar los cambios de las concentraciones de cAMP después de que un neurotransmisor se uniera a un receptor de superficie.
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Otra innovación de la microscopia por fluorescencia ha sido la elaboración de programas computacionales, para generar gran numero de imágenes y calificarlas con base en diversas características. Las técnicas automatizadas comentadas han sido particularmente útiles para detectar los fenotipos de células sometidas a una “biblioteca” de siRNA diferentes, en la búsqueda de genes que codifiquen proteínas que intervengan en un proceso celular particular como es el tránsito de membranas (pág. 278) o la mitosis (pág. 780). Además de ser una maniobra tediosa y lenta, el intento de analizar por técnicas manuales galerías de imágenes como las que se muestran en la figura 18.50, quizá introduzca errores que son consecuencia de diferencias subjetivas inherentes y sesgos de observadores humanos.
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Otra innovación reciente en la microscopia por fluorescencia es el terreno de la microscopia multifotónica, en que los fluoróforos presentes en el interior de células son excitados por la llegada simultánea de dos o más fotones de longitud de onda más larga. Cuanto más larga sea la longitud de onda del fotón, menor será su energía (de modo que los torna menos destructivos de las células iluminadas y para la absorción de fluoróforos) y mayor será su capacidad de penetración. Por el uso de microscopia multifotónica los investigadores pueden rastrear los desplazamientos de proteínas fluorescentes que se encuentran como mínimo a una profundidad de 200 μm en el interior de tejido vivo. Un ejemplo de tal técnica se incluye en la figura 17.11 en que las células inmunitarias marcadas por fluorescencia son “vigiladas” conforme se desplazan en el interior de un ganglio linfático extirpado.
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Microscopia con video y procesamiento de imágenes
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Así como el campo microscópico puede verse con los ojos o filmarse con una cámara, también puede verse por medios electrónicos y grabarse con una videocámara. Las videocámaras ofrecen varias ventajas para visualizar muestras. Se construyen tipos especiales de videocámaras (llamadas dispositivo acoplado a la carga [CCD, charge-coupled device], o cámaras CCD) que son muy sensibles a la luz, lo que les permite obtener imágenes con iluminación escasa. Esto es muy útil cuando se observan especímenes vivos, a los que el calor de una fuente luminosa daña con facilidad y especímenes con tinción fluorescente, que se desvanece en poco tiempo con la exposición a la luz. Además, las videocámaras pueden detectar y amplificar diferencias muy pequeñas en el contraste dentro de una muestra, de manera que los objetos muy pequeños se tornan visibles. Por ejemplo, las fotografías de la figura 9.22a exponen imágenes de microtúbulos individuales (diámetro 0.025 μm) que están muy por debajo del límite de resolución de un microscopio óptico estándar (0.2 μm). Una ventaja adicional es que las imágenes electrónicas generadas por cámaras de video son transformadas fácilmente en imágenes digitales y estas últimas incluyen un número discreto de elementos gráficos (pixeles), de modo que a cada uno se ha asignado un valor cromático y de brillo correspondiente al sitio de la imagen original. Las imágenes digitales se almacenan como archivos en computadoras y se someten a procesamiento para ampliar enormemente su contenido informativo. En una técnica, el fondo desenfocado distractor de un campo visual se almacena en la computadora y luego se sustrae de la imagen que contiene la muestra. Esto incrementa mucho la claridad de la imagen. De igual manera las diferencias de la brillantez en la imagen pueden convertirse en diferencias de color, lo que las vuelve mucho más evidentes al ojo humano.
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Microscopia confocal de barrido láser
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El uso de videocámaras, imágenes electrónicas y procesamiento por computadora condujo al renacimiento de la microscopia óptica en los últimos 20 años. También contribuyó el desarrollo de un nuevo microscopio óptico. Cuando se examina una célula completa o un corte de algún órgano con un microscopio óptico estándar, el observador ve la muestra a distintas profundidades si cambia la posición del objetivo mediante la rotación del tornillo de enfoque. Mientras lo hace, distintas partes de la muestra entran y salen de foco. Sin embargo, el hecho de que la muestra contenga diferentes enfoques disminuye la capacidad para formar una imagen nítida porque las partes de la muestra por arriba y por abajo del plano de foco interfieren con los rayos de luz de la parte que está en dicho plano. A finales del decenio de 1950, Marvin Minsky, del Massachusetts Institute of Technology, inventó un instrumento revolucionario llamado microscopio confocal que produce una imagen de un plano delgado situado dentro de una muestra mucho más gruesa. La figura 18.9a muestra un diagrama de los componentes ópticos y los trayectos de luz en una versión moderna de un microscopio óptico de barrido confocal de fluorescencia. En este tipo de microscopio la muestra se ilumina con un rayo láser con un enfoque fino que barre rápidamente la muestra a una sola profundidad, con lo que sólo ilumina un plano delgado (o “corte óptico”) dentro de la muestra. Como se describe en la figura 18.9a, los microscopios confocales se utilizan con óptica fluorescente. Como se explicó antes, los fluorocromos presentes en una muestra absorben la luz incidente de longitud de onda corta y la emiten de nuevo en una longitud de onda mayor. La luz emitida por la muestra se enfoca en un sitio del microscopio que contiene una abertura puntual. Por lo tanto, la abertura y el plano iluminado son confocales. Los rayos de luz emitidos por el plano iluminado de la muestra pueden pasar por la abertura, mientras que el paso de cualquier otro rayo de luz que pudiera emanar de un plano superior o inferior al plano determinado se impide para que no participe en la formación de la imagen. En consecuencia los puntos fuera de foco de la muestra se tornan invisibles.
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La figura 18.9b presenta micrografías de un solo núcleo celular que se tomaron en tres planos distintos de la muestra. Es evidente que los objetos fuera del plano de enfoque tienen poco efecto en la calidad de la imagen de cada corte. Si se desea, las imágenes de cortes ópticos separados pueden almacenarse en una computadora y fusionarse para reconstruir un modelo tridimensional de todo el objeto.
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Microscopio de fluorescencia con súper resolución
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Las innovaciones más recientes en la microscopia de fluorescencia caen en el campo de las tecnologías de “súper resolución”. En la página 734 se indicó que el límite de resolución del microscopio óptico se aproxima a 200 nm por las propiedades de difracción de la luz. En los últimos años se desarrollaron varias técnicas ópticas complejas que permiten a los investigadores localizar proteínas con marcas fluorescentes en resoluciones en décimas de nanómetros. Muchas de estas técnicas de súper resolución se basan en el descubrimiento de que una mutación particular de polipéptido GFP transforma la proteína en una molécula fotoactivable (PA-GFP, photoactivatable molecule), y dicha GFP mutante sigue siendo no fluorescente hasta que la luz violeta la activa. Estudios ulteriores han ampliado el número de proteínas fluorescentes fotoactivables que pueden usarse y ello ha permitido crear proteínas “fotoconmutables” cuya emisión fluorescente en una longitud particular de onda puede activarse o desactivarse con pulsos luminosos. Sólo se describirá en forma breve una de estas técnicas, llamada STORM (stochastic optical reconstruction microscopy, microscopia de reconstrucción óptica estocástica), que permite a los investigadores localizar una molécula fluorescente individual con una resolución menor de 20 nm. En el caso de esta técnica, se ilumina la muestra que contiene uno o más fluoróforos fotoconmutables con pulsos de luz de longitud de onda adecuada, que actúa al “conmutar”, es decir, activar o desactivar la fluorescencia de las moléculas marcadas. Durante cada ciclo de iluminación, muchas de las moléculas marcadas siguen estando oscuras, pero una pequeña fracción de ellas es activada de manera aleatoria. Dichas moléculas fluorescentes activadas individualmente asumen la forma de pequeñas zonas o puntos, que dadas las propiedades de difracción de la luz, tienen algunos cientos de nanómetros de diámetro. El centro de cada zona o punto, que representa el sitio real del fluoróforo particular que emite la luz, se puede conocer con gran exactitud; el proceso comentado se repite varios ciclos imagenológicos y así se genera un gran número de coordenadas que representan el sitio de muchos de los fluoróforos en la muestra. El análisis de las coordenadas permite a los investigadores reconstruir una imagen de súper resolución del campo de visión. El gran aumento en la resolución que puede obtenerse con la técnica STORM de súper resolución en comparación con una técnica de fluorescencia convencional resulta evidente si se compara la imagen de la figura 18.10a con las figuras 18.10b y c.
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