Capítulo 7: Farmacogenética

Es un hecho que los pacientes varían en sus respuestas a la terapia con medicamentos. Algunos pacientes obtienen beneficios llamativos y sostenidos con la administración de un fármaco; otros pueden no mostrar ningún beneficio, y otros muestran reacciones adversas (ADR) leves, graves o incluso fatales. Las fuentes comunes de dicha variabilidad incluyen el incumplimiento, los errores de medicación, las interacciones medicamentosas (véanse capítulo 4 y apéndice I) y los factores genéticos. La farmacogenética es el estudio de la base genética para la variación en la respuesta al fármaco y, a menudo, implica grandes efectos de un pequeño número de variantes en el DNA. La farmacogenómica, por otro lado, estudia un mayor número de variantes, en un individuo o en una población, para explicar el componente genético de las respuestas variables a los fármacos. Descubrir qué variantes o combinaciones de variantes tienen consecuencias funcionales para los efectos de los medicamentos, validar esos descubrimientos y, finalmente, aplicarlos en la atención al paciente y al descubrimiento de fármacos, son las tareas de la farmacogenética y la farmacogenómica modernas.

La respuesta de un individuo a un medicamento depende de la interacción compleja entre los factores ambientales (p. ej., dieta, edad, infecciones, otras drogas, nivel de ejercicio, ocupación, exposición a toxinas y consumo de tabaco y alcohol) y los factores genéticos. La variación genética puede dar como resultado una secuencia y función alterada de la proteína o niveles de proteína alterados a través de la variación reguladora. Los principales genes implicados en la conducción de las acciones de los fármacos incluyen aquellos que codifican las enzimas metabolizadoras de fármacos, las moléculas para el transporte de estos, los blancos moleculares con los que interactúan los medicamentos y una serie de otros genes que modulan el contexto molecular dentro del cual actúan los medicamentos, especialmente los genes desregulados por la enfermedad para la cual se administra el medicamento. En algunas situaciones, la variación en genomas no de línea germinal (p. ej., en cánceres o en agentes infecciosos) puede ser el determinante crítico en las respuestas variables a los fármacos.

El metabolismo farmacológico es altamente heredable, evaluado mediante la exposición a los fármacos en gemelos monocigóticos frente a gemelos fraternos, en exposiciones a fármacos en líneas celulares de sujetos relacionados, o en los análisis de conjuntos de datos muy grandes que utilizan tecnologías tales como el genotipado del genoma completo, lo que será discutido más adelante en este capítulo. Los estudios con gemelos sugirieron que hasta 75% de la variabilidad en la vida media de eliminación de los fármacos metabolizados puede ser hereditaria. Algunos rasgos del metabolismo de los fármacos se comportan de una manera "monogénica" convencional con tres grupos de fenotipos definibles de respuesta a fármacos (y separables): heterocigotos y homocigotos de alelos mayores y menores. El estudio de estos tipos de respuestas ha ayudado a definir variantes genéticas claves que contribuyen a la sorprendente variabilidad en las respuestas descritas en este capítulo. Sin embargo, las variantes únicas de gran tamaño de efecto son la excepción, y para muchas (la mayoría) de las respuestas a los fármacos, el componente genético de las respuestas variables, aunque sustancial, probablemente refleje las influencias interactivas de muchas variantes genéticas. Un desafío importante para el campo es acumular un gran número de sujetos con respuestas farmacológicas bien fenotipadas para permitir el descubrimiento y posterior replicación y validación de los efectos multigénicos o de las interacciones de los genes con los factores ambientales.

Terminología basada en el fenotipo

Un rasgo (p. ej., el "metabolizador pobre" [PM] del CYP2D6, en oposición al "metabolizador extensivo" [EM, extensive metabolizer]) puede ser evidente sólo con alelos no funcionales en los cromosomas maternos y paternos. Si el gen está en un cromosoma no sexual, el rasgo es autosómico. Los alelos no funcionales pueden ser iguales; entonces el rasgo se denomina autosómico recesivo o diferente, en cuyo caso el sujeto es un heterocigoto compuesto. Un rasgo se considera codominante si los heterocigotos exhiben un fenotipo que es intermedio al de los homocigotos para el alelo común y los homocigotos para el alelo variante. Muchos rasgos polimórficos (p. ej., el metabolismo del CYP2C19 de fármacos tales como clopidogrel y omeprazol) ahora se sabe que exhiben algún grado de codominancia; como resultado, los heterocigotos exhiben actividad metabolizante que es intermedia entre los sujetos EM y PM.

En algunos casos, como el clopidogrel, la codeína y el irinotecán (descritos más adelante en este capítulo), las variantes en un único gen producen diferencias muy bien definidas y clínicamente importantes en la respuesta al fármaco. Sin embargo, estos ejemplos de gran magnitud de efecto son la excepción por dos razones. En primer lugar, incluso dentro de un solo gen, es posible una amplia gama de polimorfismos (promotor, codificación, no codificación, completamente inactivante o muy poco modificado). Cada polimorfismo puede producir un efecto diferente en la función del gen y, por tanto, afectar diferencialmente un rasgo medido. En segundo lugar, incluso si las designaciones de recesivo, codominante y dominante son informativas para un gen dado, su utilidad para describir la variabilidad genética que subyace a la variabilidad en el fenotipo de la respuesta al fármaco disminuye porque la variabilidad es a menudo multigénica.

Tipos de variantes genéticas

Los principales tipos de variación de secuencia son los polimorfismos de un solo nucleótido (SNP, a veces denominados variantes de nucleótido único, SNV), y las inserciones o deleciones, que pueden variar en tamaño desde un solo nucleótido hasta un cromosoma entero; los más pequeños generalmente se denominan indels, y los más grandes se les llama CNV. Los SNP son mucho más comunes que los indels o CNVs (figura 7-1). El término polimorfismo se aplicaba anteriormente a variantes que se producen a una frecuencia superior a 1%. Sin embargo, la aplicación de la secuenciación del genoma a grandes números de sujetos ha dejado en claro que cada individuo tiene más de 10 millones de sitios en su genoma en los que difieren de alguna secuencia de referencia (es decir, ∼1 variante por 1 000 pares de bases). Si bien algunos de éstos son "comunes" (>1% de frecuencia), la gran mayoría son mucho más raros. Para variantes raras claramente asociadas con una enfermedad genética, también se puede usar el término mutación, pero puede ser difícil distinguir entre una variante muy rara y una mutación. Bases de datos basadas en la web disponibles públicamente (p. ej., http://gnomad.broadinstitute.org) agregan datos de secuencia en decenas de miles de sujetos y resaltan que los MAF pueden variar notablemente entre ancestros (discutido más adelante), y que para la gran mayoría de variantes es mucho menor que 1%.

Los SNP en la región de codificación se denominan cSNP y se clasifican además como no sinónimo (cambiando la secuencia de aminoácidos codificada) o sinónimos (o sentido, sin cambios de aminoácidos). Una sustitución de nucleótidos en un nsSNP que cambia el codón de aminoácidos (p. ej., prolina [CCG] a glutamina [CAG]) puede como resultado cambiar la estructura de la proteína, la estabilidad o las afinidades del sustrato. Hay 64 codones de trinucleótidos y sólo 20 aminoácidos, por lo que codones múltiples codifican el mismo aminoácido. A menudo, las sustituciones del tercer par de bases, denominado posición de oscilación, en un codón con 3 pares de bases, como la sustitución G a A en la prolina (CCG → CCA), no alteran el aminoácido codificado. Hasta aproximadamente 10% de los SNP muestran más de dos alelos posibles (p. ej., una C puede reemplazarse por una A o una G), de modo que el mismo sitio polimórfico puede asociarse con sustituciones de aminoácidos en algunos alelos pero no en otros. Como se discute en el material que sigue, la evaluación de las consecuencias funcionales de nsSNP puede ser desafiante. Los SNP que introducen un codón de terminación prematuro e indels pequeños en una región codificante que interrumpen el marco de lectura abierto y de ese modo introducen secuencias de proteína 3' anormales a menudo con codones de terminación temprana, se denominan variantes sin sentido, y se cree que son más propensos a mostrar función proteica anormal.

Los polimorfismos sinónimos han contribuido a un rasgo fenotípico. Un ejemplo es un polimorfismo en ABCB1, que codifica MDR1 (también denominada P-glucoproteína), una bomba de eflujo que interactúa con muchos fármacos utilizados clínicamente. En MDR1, un polimorfismo sinónimo, C3435T, se asocia con diversos fenotipos, y algunas pruebas indican que uno de los RNAm resultantes se traduce a un ritmo más lento, lo que altera el plegamiento de la proteína, su inserción en la membrana y, por tanto, su interacción con medicamentos (Kimchi-Sarfaty et al., 2007).

La gran mayoría (>97-99%) del DNA humano es no codificante, y las funciones reguladoras de las secuencias no codificantes sólo se están definiendo ahora. Los polimorfismos en las regiones no codificadoras pueden ocurrir en las regiones 3' y 5' no traducidas, en regiones promotoras o potenciadoras, en regiones intrónicas, o en regiones grandes entre genes, regiones intergénicas (para la guía de nomenclatura, véase la figura 7-2). Se cree que los SNP no codificantes en las secuencias promotoras o potenciadoras alteran la unión del DNA a las proteínas reguladoras para afectar la transcripción. Los 3' SNP pueden alterar la unión de microRNA que afectan la estabilidad de la transcripción. Los SNP que no codifican también pueden crear sitios de corte y empalme de intrones y exones alternativos, y la transcripción alterada puede tener menos o más exones, o exones más cortos o más largos, que la transcripción de tipo salvaje. Los grandes consorcios están definiendo las funciones del DNA no codificante: el proyecto ENCODE identifica elementos funcionales (potenciadores, promotores, etc.) en las secuencias del genoma; y GTEx relaciona la variación de la secuencia del genoma con la variabilidad específica del tejido en la expresión génica (ENCODE Project Consortium, 2012; GTEx Consortium, 2015).

Al igual que los SNP, los indels pueden ser repeticiones cortas en el promotor (lo que puede afectar la cantidad de la transcripción) o inserciones/deleciones que suman o restan aminoácidos en la región de codificación. El número de repeticiones TA en el promotor UGT1A1 afecta la expresión cuantitativa de esta importante glucuronosiltransferasa en el hígado; el alelo más común tiene seis repeticiones y la variante de siete repeticiones (UGT1A1*28) disminuye la expresión de UGT1A1. La frecuencia del alelo *28 es de hasta 30%, con hasta 10% de sujetos (dependiendo de la ascendencia) siendo homocigotos. La disminución de la transcripción de UGT1A1 puede modular las acciones del fármaco como se describe más adelante en el capítulo y también representa una forma común de hiperbilirrubinemia leve (síndrome de Gilbert, véanse la tabla 6-3 y la figura 6-7).

Las CNV parecen suceder en aproximadamente 10% del genoma humano y en un estudio representaron cerca de 18% de la variación genética detectada en la expresión de aproximadamente 15 000 genes en líneas celulares de linfoblastoides (Stranger et al., 2007). El fenotipo metabolizador CYP2D6 ultrarrápido surge como resultado de la(s) duplicación (duplicaciones) de CYP2D6, y se han descrito individuos con más de 10 copias funcionales del gen. Un polimorfismo GSTM1 común es causado por una deleción grande (50 kb), y el alelo nulo tiene una frecuencia de población de 30-50%. Los estudios bioquímicos indicaron que los hígados de individuos homocigóticos nulos tienen sólo aproximadamente 50% de la capacidad de conjugación del glutatión que aquellos con al menos una copia del gen GSTM1.

Un haplotipo, una serie de alelos vinculados encontrados en un locus en un cromosoma, especifica la variación de la secuencia de DNA en un gen o región de un gen en un cromosoma. Por ejemplo, considere dos SNP en ABCB1. Un SNP es una sustitución de pares de bases T a A en la posición 3421, y el otro es un cambio de C a T en la posición 3435. Los haplotipos posibles serían T₃₄₂₁C₃₄₃₅, T₃₄₂₁T₃₄₃₅, A₃₄₂₁C₃₄₃₅ y A₃₄₂₁T₃₄₃₅. Para cualquier gen, los individuos tendrán dos haplotipos, uno de origen materno y otro de origen paterno. Un haplotipo representa la constelación de variantes que se producen juntas para el gen en cada cromosoma. En algunos casos, esta constelación de variantes, en lugar de la variante individual o el alelo, puede ser funcionalmente importante. En otros, sin embargo, una sola variante también puede serlo, sin importar la presencia de otras variantes vinculadas dentro del (de los) haplotipo(s).

El desequilibrio del ligamiento es el término utilizado para describir la situación en la que los genotipos en los dos loci no son independientes entre sí. Con el desequilibrio del ligamiento completo, el genotipo en un sitio es un predictor perfecto del genotipo en el sitio vinculado. Los patrones de desequilibrio del ligamiento son específicos de la población, y a medida que se produce la recombinación, el desequilibrio del ligamiento entre dos alelos se desintegrará y se producirá el equilibrio del ligamiento. El desequilibrio del ligamiento ha permitido estudios de asociación de todo el genoma porque el genotipado en un pequeño número de SNP ("SNPs de etiqueta") en el desequilibrio del ligamiento con muchos otros puede capturar la variación común entre las regiones.

Diversidad ancestral

Los polimorfismos difieren en sus frecuencias dentro de las poblaciones humanas y han sido clasificados como cosmopolitas o específicos de la población (o raza y etnia). Los polimorfismos cosmopolitas son aquellos polimorfismos presentes en todos los grupos étnicos y es probable que sean antiguos, surgidos antes de las migraciones de humanos desde África, aunque las frecuencias actuales pueden diferir entre los grupos ancestrales. La presencia de polimorfismos ancestrales específicos es consistente con el aislamiento geográfico de poblaciones humanas. Estos polimorfismos probablemente surgieron en poblaciones aisladas y luego alcanzaron cierta frecuencia porque son ventajosos de alguna manera (selección positiva) o neutrales para una población. Los individuos descendientes de múltiples ancestros pueden mostrar estructuras de haplotipos y frecuencias alélicas intermedias entre sus padres. En Estados Unidos, los afroamericanos tienen el mayor número de polimorfismos específicos de la población (y los bloques de haplotipos más pequeños) en comparación con los estadounidenses de origen europeo, los mexicoamericanos y los asiaticoamericanos.

Hay muchas consideraciones importantes para la realización de un experimento diseñado para identificar las fuentes de variación genética que contribuyen a las respuestas variables a los fármacos. Éstos incluyen material a estudiar (p. ej., células, órganos, sujetos humanos); los antecedentes genéticos de los sujetos; la presencia de factores de confusión como la dieta o condiciones experimentales variables; la selección de las variantes que se estudiarán (que van desde un solo SNP candidato de alta probabilidad hasta enfoques "agnósticos" que interrogan al genoma completo); los métodos usados para genotipado y control de calidad; consideraciones de análisis estadístico, incluidas las estimaciones de la magnitud del efecto y la consideración de ascendencia; y la replicación de los resultados.

Rasgos farmacogenéticos

Un rasgo farmacogenético es cualquier rasgo medible o discernible asociado con un medicamento. Algunos rasgos reflejan el efecto beneficioso o adverso de un medicamento en un paciente; la disminución de la presión sanguínea o la reducción del tamaño del tumor son ejemplos. Éstos tienen la desventaja de que reflejan muchas influencias genéticas y no genéticas, pero la ventaja de que indican los efectos clínicos de un medicamento. Otros rasgos representan "endofenotipos" de respuesta a fármacos, medidas que pueden reflejar más directamente la acción de un fármaco en un sistema biológico y, por tanto, ser más susceptibles de estudio genético, pero pueden eliminarse de todo el paciente o de toda una población. Los ejemplos de estos últimos incluyen actividad enzimática, niveles de fármaco o metabolito en plasma u orina, o cambios inducidos por fármacos en los patrones de expresión génica.

Se puede inferir una variante de un fenotipo de metabolizador de fármaco a partir de los datos del genotipo o, en algunos casos, directamente medido administrando un "fármaco de sonda" (que se cree que se metaboliza por una vía única) y midiendo las concentraciones del fármaco y del metabolito. Por ejemplo, un método para determinar el estado del metabolizador de CYP2D6 es medir la proporción urinaria del fármaco padre al metabolito después de una dosis oral única del sustrato de CYP2D6 dextrometorfano. De forma similar, la mefenitoína puede usarse como un fármaco sonda para el fenotipo metabolizador CYP2C19. Una advertencia importante es que otros medicamentos pueden interferir con esta evaluación: si el dextrometorfano se administra con un inhibidor potente de CYP2D6, como quinidina o fluoxetina, el fenotipo puede ser consistente o una "fenocopia del genotipo metaboglizador pobre", incluso aunque el sujeto porta alelos de CYP2D6 de tipo salvaje. En este caso, la asignación de un fenotipo metabolizador lento CYP2D6 no sería precisa. Otro endofenotipo farmacogenético, la prueba de aliento de eritromicina (para actividad de CYP3A), a veces puede ser inestable dentro de un sujeto, lo que indica que el fenotipo está muy influido por factores no genéticos o multigénicos. La mayoría de los rasgos farmacogenéticos son multigénicos más que monogénicos (figura 7-3), y se está haciendo un esfuerzo considerable para identificar los polimorfismos importantes que influyen en la variabilidad de la respuesta al fármaco.

Genotipado

La mayoría de los métodos de genotipado utilizan DNA extraído de las células somáticas y diploides, generalmente glóbulos blancos o células bucales. Este DNA de la "línea germinal" es extremadamente estable si se extrae y se almacena de manera adecuada, y la secuencia de DNA generalmente es (aunque no del todo) invariante a lo largo de la vida de un individuo. Cualquier resultado de genotipado debe estar sujeto a un control de calidad estándar y riguroso, que puede incluir la inspección de datos experimentales del genotipado de origen, la exclusión de SNP con una tasa de fallo de genotipificación elevada, la exclusión de sujetos en los que muchos análisis de SNP fallaron, la evaluación del equilibrio de Hardy Weinberg y la verificación de ausencia de subestructura importante (p. ej., muchos individuos relacionados) en un estudio de población general. El equilibrio de Hardy Weinberg se mantiene cuando el apareamiento dentro de una población es aleatorio y no existe un efecto de selección natural sobre la variante. Tales suposiciones se describen matemáticamente cuando las proporciones de la población que se observa que son homocigóticas para el genotipo de la variante (q²), homocigóticas para el genotipo de tipo salvaje (p²) y heterocigóticas (2*p*q) no son significativamente diferentes a las de las frecuencia predicha de alelos generales (p = frecuencia del alelo de tipo salvaje, q = frecuencia del alelo variante) en la población. Una desviación del equilibrio de Hardy Weinberg (es decir, de la regla de que p² + 2pq + q² = 1) sugiere una desventaja de supervivencia específica para un genotipo particular o un genotipado u otro error experimental.

El gen candidato frente a los amplios enfoques genómicos

Un estudio del gen candidato usa lo que se conoce acerca de un fármaco (p. ej., su metabolismo, transporte o mecanismo de acción) para probar la hipótesis de que las variantes en los genes subyacentes son causas de los fenotipos con respuestas variables al fármaco. Se pueden elegir variantes porque son comunes, conocidas (o pensadas) para ser funcionales, o etiquetar bloques de haplotipos. Después de desarrollar los ensayos para un conjunto de tales variantes, se usan métodos estadísticos para relacionar el genotipo con el fenotipo. Existen varias bases de datos que contienen información sobre polimorfismos en genes humanos (tabla 7-1); estas bases de datos permiten al investigador buscar por genes para polimorfismos informados. Algunas de las bases de datos, como PharmGKB, incluyen datos fenotípicos y genotípicos.

Enfoques "agnósticos" a gran escala

Si bien el enfoque del gen candidato tiene el atractivo intuitivo de que se estudian las vías conocidas de respuesta al fármaco, tiene el inconveniente de buscar sólo en regiones de actividad biológica conocida. De hecho, los estudios genéticos candidatos para la susceptibilidad a enfermedades comunes tienen una tasa notablemente alta de fracaso al ser replicados, y esto se ha atribuido a la ingenuidad sobre la naturaleza poligénica de la mayoría de los rasgos, tamaños pequeños con bajo poder y una "maldición ganadora" en la que sólo los resultados positivos se publican (Ioannidis et al., 2001). Se ha argumentado que, a diferencia de los estudios de enfermedades comunes, el precedente ha demostrado que las respuestas a los fármacos pueden reflejar gran magnitud de efecto de un pequeño número de genes, pero estas limitaciones deben tenerse en cuenta en la realización de estos estudios.

Un enfoque alternativo al del gen candidato es un GWAS, en el que los genotipos en más de 500 000 sitios de SNP (generalmente marcando bloques de haplotipos en el genoma) se comparan a través de un rasgo continuo o entre casos y controles (p. ej., aquellos con o sin un tratamiento respuesta o una ADR). Un GWAS requiere un gran número de sujetos, debe considerar los enfoques estadísticos apropiados para minimizar los errores de tipo I (falsos positivos) y, si tiene éxito, identifica los loci de interés que requieren mayor investigación para identificar las variantes causales y la biología subyacente. Si bien las asociaciones identificadas por GWAS generalmente tienen tamaños de efecto modestos (razones probables <2), incluso con muy bajos valores de P, los GWAS farmacogenéticos brindan algunas excepciones; por ejemplo, un GWAS en 51 casos de hepatotoxicidad inducida por flucloxacilina y 282 controles identificaron SNP de riesgo en el locus HLA-B con una razón probable superior a 80 (Daly et al., 2009). No todos los GWAS farmacogenéticos han identificado con éxito señales con esta fortaleza, pero el enfoque tiene cierta promesa y se usa cada vez más (Karnes et al., 2015; Mosley et al., 2015; Motsinger-Reif et al., 2013; Van Driest et al., 2015).

Los análisis GWAS también han proporcionado un fuerte respaldo para estudios de genes candidatos que implican variantes en CYP2C9 y VKORC1 con el requerimiento de dosis de warfarina (Cooper et al., 2008; Takeuchi et al., 2009; véanse figura 32-6 y tabla 32-2) y variantes en CYP2C19 en la respuesta clínica al clopidogrel (Shuldiner et al., 2009). Las nuevas plataformas de genotipado pueden capturar tanto variantes de regiones de codificación como etiquetas para bloques de haplotipos comunes, y la disponibilidad de cantidades crecientes de datos de secuencias permite inferencias razonables (mediante un método estadístico llamado imputación) de hasta 10 millones de genotipos de un experimento de genotipado de GWAS.

Si bien enfoques experimentales únicos pueden sugerir una relación entre las respuestas variables de los fármacos y una variante en un locus o gen específico, el uso de múltiples enfoques complementarios proporciona la evidencia más sólida que respalda tales relaciones. Un método es establecer que las variantes putativas de hecho muestran una función alterada en un sistema in vitro, como se discute en el material que sigue. Otro enfoque es integrar los datos de genotipo (por GWAS) con otras medidas a gran escala de la función del gen, como la abundancia de RNAm (transcriptómica) o proteínas (proteómica). Esto tiene la ventaja de que la abundancia de la señal puede reflejar directamente parte de la variación genética relevante. Uno de tales estudios identificó seis loci en los cuales la exposición a simvastatina en las líneas celulares cambió la expresión génica, y las variantes en uno de estos genes, la glicina amidinotransferasa, se asociaron con la motoxicidad por simvastatina en un ensayo clínico (Mangravite et al., 2013). Sin embargo, tanto la expresión del RNAm como la de la proteína están muy influidas por la elección del tipo de tejido, que puede no estar disponible; por ejemplo, puede no ser factible obtener biopsias de tejido cerebral para estudios de toxicidad del CNS. El proyecto GTEx descrito anteriormente acopla la secuencia del genoma completo a los niveles de transcripción del RNAm a través de múltiples tejidos y podría permitir otros estudios de este tipo.

El acoplamiento a gran escala de los genotipos con los fenotipos en sistemas EMR con biobancos de DNA asociados representa otro recurso potencial para los estudios de farmacogenómica. Un enfoque interesante que utiliza tales biobancos es cambiar el paradigma de GWAS "de cabeza" y preguntar con qué fenotipo humano se asocia una variante genética particular. Este PheWAS puede usarse para replicar un resultado de GWAS o para identificar asociaciones completamente nuevas (Denny et al., 2013) y se ha utilizado para "reutilizar" (sugerir nuevas indicaciones para) los fármacos comercializados (Rastegar-Mojarad et al., 2015).

Estudios funcionales de polimorfismos

Una vez que se identifica un gen o un locus que modula un fenotipo de respuesta al fármaco, un desafío importante es establecer qué codificación o variantes reguladoras contribuyen. La genómica comparada y los estudios funcionales de polimorfismos individuales in vitro y en modelos animales son enfoques que se utilizan comúnmente. Los precedentes de las enfermedades mendelianas sugieren que las variantes con las mayores magnitudes de efectos potenciales son variantes raras sin sentido o variantes de sentido erróneo que alteran drásticamente los residuos conservados de modo evolutivo. Por ejemplo, los estudios de variantes en transportadores de membrana y canales iónicos sugirieron que aquellos que le otorgan el mayor cambio en la función tienen bajas frecuencias de alelos y cambian un residuo de aminoácido conservado de manera evolutiva. Estos datos indican que los SNP que alteran los residuos conservados de manera evolutiva son los más perjudiciales. Por ejemplo, la sustitución de un aminoácido cargado (Arg) por un aminoácido no polar, no cargado (Cys) es más probable que afecte a la función que la sustitución de residuos que son más similares químicamente (p. ej., Arg a Lys). Los datos también sugieren que los nsSNP raros tienen más probabilidades de alterar la función que los comunes.

El vínculo entre la enfermedad mendeliana y la variante de respuesta farmacológica se ve resaltado por el hecho de que uno de los primeros ejemplos farmacogenéticos descubiertos fue la deficiencia de G6PD, un rasgo monogénico ligado al cromosoma X que produce anemia hemolítica grave en individuos después de la ingestión de habas o varios fármacos, incluyendo muchos agentes antipalúdicos. La G6PD normalmente está presente en los glóbulos rojos y regula los niveles del glutatión antioxidante. Los antimaláricos, como la primaquina, aumentan la fragilidad de los glóbulos rojos en individuos con deficiencia de G6PD, lo que lleva a una anemia hemolítica profunda; el rasgo es más común en los afroamericanos. La gravedad del síndrome de deficiencia varía entre los individuos y está relacionada con la variante de aminoácidos en G6PD. La forma grave de la deficiencia de G6PD se asocia con cambios en los residuos que están altamente conservados a lo largo de la historia evolutiva. La información en la tabla 7-2 sobre polimorfismos genéticos que influyen en la respuesta al fármaco, al final del capítulo, se puede utilizar como guía para priorizar polimorfismos en estudios de asociación de genes candidatos.

Con la creciente aplicación del exoma o la secuenciación del genoma completo en las poblaciones, se están identificando millones de variantes de DNA, y los métodos para establecer su función están evolucionando. En un enfoque se utilizan algoritmos computacionales para identificar sustituciones de aminoácidos potencialmente nocivas. Los métodos anteriores (p. ej., BLOSUM62, SIFT y PolyPhen) utilizan comparaciones de secuencias en múltiples especies para identificar y anotar las sustituciones, especialmente en residuos muy conservados. Enfoques más recientes usan predicciones estructurales (Kircher et al., 2014) o integran predictores múltiples (p. ej., CADD). Si bien estos programas se están volviendo cada vez más sofisticados, aún no han llegado al punto en que puedan sustituir la verificación experimental.

La actividad funcional de las variantes de aminoácidos para muchas proteínas se puede estudiar de forma aislada, en ensayos celulares o en modelos animales. Un paso tradicional en el estudio celular de una variante no sinónima es aislar el gen variante o construir la variante mediante mutagénesis dirigida al sitio, expresarlo en células y comparar su actividad funcional (actividad enzimática, cinética de transporte, activación del canal iónico, etc.) a la de la proteína de referencia o a la de la forma más común (figura 7-4). En la figura 7-5 se muestra un ejemplo de cómo la combinación de estudios de población, ensayos funcionales in vitro y simulaciones in silico se pueden integrar para identificar una variante que modula el riesgo de arritmias inducidas por fármacos.

Los SNP identificados en GWAS como asociados con fenotipos clínicos, incluidos los fenotipos de respuesta a fármacos, han estado en gran medida en regiones no codificadoras. Un ejemplo del efecto funcional profundo de un SNP no codificante es proporcionado por CYP3A5; un SNP intrónico común no codificante en CYP3A5 representa su expresión polimórfica en humanos. El SNP que representa la variación en la proteína CYP3A5 crea un sitio de empalme alternativo, lo que resulta no sólo en una transcripción con un exón 3 mayor sino también en la introducción de un codón de terminación temprana (figura 7-6). El alelo no funcional es más común en sujetos de ascendencia europea en comparación con los de ascendencia africana; como resultado, la actividad de CYP3A5 es menor en individuos que expresan el SNP intrónico no codificante (es decir, para una dosis dada de un fármaco que es un sustrato de CYP3A5, las concentraciones del fármaco serán mayores en los europeos). El aumento de las tasas de rechazo de trasplantes en personas de ascendencia africana puede reflejar concentraciones plasmáticas disminuidas del tacrolimús, un sustrato para CYP3A5 (la forma de actividad más alta que carece del SNP intrónico no codificante) (Birdwell et al., 2012).

Dos nuevas tecnologías parecen estar a punto de revolucionar los estudios funcionales. La primera es la capacidad de generar iPSC de cualquier individuo y luego usar las células para generar tipos celulares específicos (hepatocitos, cardiomiocitos, neuronas, etc.), lo que permite estudios de la fisiología celular de ese individuo. El segundo es la edición rápida y eficiente del genoma usando CRISPR/cas9 en iPSC o en cualquier otro sistema celular (véase capítulo 3). Se están explorando múltiples aplicaciones estimulantes de la tecnología de edición del genoma, desde la generación rápida de animales genéticamente modificados hasta la curación de enfermedades genéticas en humanos. La edición del genoma mantiene la promesa de que la función de las variantes individuales de codificación o no codificación, solas o combinadas, puede evaluarse rápidamente en sistemas celulares.

Fenotipos farmacogenéticos

Los genes candidatos para la respuesta terapéutica y adversa se pueden dividir en tres categorías:

• aquellos que modifican la disposición del medicamento (farmacocinética).

• aquellos que alteran la función de las moléculas con las que los medicamentos interactúan para producir sus efectos beneficiosos o adversos (receptor/objetivo).

• aquellos que alteran el amplio entorno biológico en el que los medicamentos interactúan con las moléculas blanco, incluidos los cambios asociados con las enfermedades para las que se prescribe el medicamento.

Esta sección resume ejemplos importantes de cada tipo, pero no puede ser todo incluido. Los recursos basados en la web como PharmGKB (tabla 7-1) pueden consultarse para los genes, las variantes, los medicamentos y las enfermedades específicas.

Alteraciones farmacocinéticas

La variabilidad de la línea germinal en los genes que codifican determinantes de la farmacocinética de un fármaco, en particular enzimas y transportadores metabolizantes, afecta las concentraciones del fármaco y, por tanto, es la principal determinante de las respuestas terapéutica y adversa al fármaco (al final del capítulo, véase la tabla 7-2 sobre la genética de los polimorfismos que influyen en la respuesta al fármaco). Una situación particularmente de alto riesgo es un fármaco con un estrecho margen terapéutico eliminado por una vía única: la pérdida de función en esa vía puede conducir a aumentos drásticos en las concentraciones del fármaco (y disminuciones en las concentraciones de metabolitos) con la consiguiente pérdida de eficacia y una mayor probabilidad de ADR (Roden y Stein, 2009). La pérdida de función puede ser genética o bien surgir como resultado de las interacciones de los fármacos o disfunción de los órganos excretores (p. ej., la insuficiencia renal elevará las concentraciones en el plasma de los fármacos excretados por el riñón a menos que se reduzcan las dosificaciones).

Un ejemplo es la CYP2C9 medida en el metabolismo del enantiómero S, forma más activa de la warfarina. Los individuos con la pérdida de la función del alelo *3 requieren dosis más bajas de warfarina en estado estable y tienen un mayor riesgo de hemorragia (Aithal et al., 1999; Kawai et al., 2014; véase también la tabla 32-2). Cuando múltiples enzimas y transportadores están involucrados en la farmacocinética de un fármaco, es poco probable que las variantes únicas produzcan grandes efectos clínicos.

Otra situación de alto riesgo es un medicamento que requiere bioactivación para lograr un efecto farmacológico. Los individuos con bioactivación aumentada o disminuida, debido a variantes genéticas o interacciones de medicamentos, están en riesgo de respuestas a los fármacos variables. El clopidogrel, bioactivado por CYP2C19, y el tamoxifeno, bioactivado por CYP2D6, son ejemplos (véanse tabla 7-2 y figura 6-3A). Los sujetos de PM homocigotos para una variante de función de pérdida común en CYP2C19 muestran una disminución de los efectos antiplaquetarios y un aumento de la trombosis del estent durante el tratamiento con clopidogrel (Mega et al., 2010; Shuldiner et al., 2009). En los heterocigotos (∼20%) que reciben clopidogrel, se pueden lograr efectos antiplaquetarios adecuados mediante el aumento de la dosis, mientras que en los homocigotos (2-3%) se debe utilizar un fármaco antiplaquetario alternativo porque incluso los aumentos de dosis grandes no afectan la función plaquetaria. Otras variantes de pérdida de función (notablemente *3) son comunes en las poblaciones de China y Japón. Varios inhibidores de la bomba de protones, incluyendo omeprazol y lansoprazol, son inactivados por el CYP2C19. Por tanto, los pacientes PM tienen una mayor exposición al fármaco parental activo, un mayor efecto farmacodinámico (pH gástrico más elevado) y una mayor probabilidad de curación ulcerosa que los heterocigotos u homocigotos de tipo salvaje.

Una variación de este tema es el uso de la codeína (un profármaco bioaccionado por CYP2D6 a morfina). En los PM, la analgesia está ausente. Quizás lo más importante es que se genera un exceso de morfina en los metabolizadores ultrarrápidos, y se ha notificado la muerte por paro respiratorio (Ciszkowski et al., 2009). Una gran cantidad de medicamentos (estimados en 15-25% de todos los medicamentos en uso) son sustratos para CYP2D6.

La variante UGT1A1*28, que codifica el promotor UGT1A1 de función reducida 7-AT mencionado previamente, se ha asociado con niveles más altos del metabolito activo SN-38 del agente quimioterapéutico del cáncer irinotecán (capítulo 66), y esta concentración incrementada se ha asociado con un mayor riesgo de toxicidad grave (véanse las figuras 6-6, 6-8 y 6-9).

Receptor de medicamentos/alteraciones del objetivo

La warfarina ejerce su efecto anticoagulante al interferir con la síntesis de los factores de coagulación dependientes de la vitamina K, y la molécula blanco con la que la warfarina interactúa para ejercer este efecto está codificada por VKORC1, una enzima en el ciclo de la vitamina K (figura 7-7). Las variantes raras de la región de codificación en el gen conducen a una resistencia a la warfarina parcial o total; curiosamente, estas variantes son comunes (5% de la frecuencia de alelos) en pacientes con Ashkenazi y pueden explicar las altas dosis requeridas en sujetos portadores. El promotor VKORC1 incluye variantes comunes que modulan fuertemente su expresión; en sujetos con expresión reducida, se requieren dosis más bajas de warfarina en estado estable. Estas variantes son más comunes en sujetos asiáticos que en caucásicos o africanos. La variación heredada en CYP2C9 y VKORC1 representa más de 50% de la variabilidad en las dosis de warfarina necesarias para alcanzar el nivel de coagulación deseado. VKORC1 es un ejemplo de cómo las variantes raras y comunes en los genes que codifican los objetivos fármacológicos pueden ejercer efectos importantes sobre las acciones de éstos.

En algunos casos, las variantes altamente penetrantes con profundas consecuencias funcionales pueden causar fenotipos de la enfermedad que confieren una presión negativa selectiva; variaciones más sutiles en los mismos genes se pueden mantener en la población sin causar enfermedad, pero causan variación en la respuesta al fármaco. Por ejemplo, las mutaciones raras de pérdida de función en la MTHFR causan retraso mental grave, enfermedad cardiovascular y una vida más corta. Por el contrario, el SNP 677C→T causa una sustitución de aminoácidos que se mantiene en la población a una frecuencia alta (40% de frecuencia de los alelos en la mayoría de las poblaciones blancas) y se asocia con una actividad de MTHFR modestamente inferior (∼30% menos que el alelo 677C) y concentraciones moderadas pero significativamente elevadas de homocisteína en el plasma (∼25% superior). Este polimorfismo no altera la farmacocinética del fármaco, pero parece modular la farmacodinámica al predisponer la toxicidad GI al fármaco antifolato metotrexato en receptores de trasplante de células madre.

Al igual que la warfarina, los efectos clínicos del metotrexato dependen de un número de polimorfismos que afectan el metabolismo, el transporte, los modificadores de fármacos y los objetivos farmacológicos. Varios de los objetivos directos (dihidrofolato reductasa, purina transformilasa y TYMS) también están sujetos a polimorfismos comunes. Un indel polimórfico en TYMS (dos frente a tres repeticiones de una secuencia de 28 pares de bases en el potenciador) afecta la cantidad de expresión de la enzima tanto en células normales como en células tumorales. El polimorfismo TYMS puede afectar tanto la toxicidad como la eficacia de agentes anticancerosos (p. ej., fluorouracilo y metotrexato) que se dirigen a TYMS. Por tanto, la contribución genética a la variabilidad en la farmacocinética y la farmacodinámica del metotrexato no puede entenderse sin evaluar genotipos en varios loci diferentes.

En la tabla 7-2, al final del capítulo, se presentan otros ejemplos de variantes de objetivos fármacológicos que afectan la respuesta del fármaco. Los polimorfismos en el receptor de la serotonina se han utilizado como predictores de la capacidad de respuesta a los antidepresivos y del riesgo general de la depresión. Los polimorfismos del receptor β-adrenérgico se han relacionado con la respuesta al asma, a los cambios en la función renal después de los inhibidores de la ACE, a la frecuencia cardiaca sinusal después de la administración de los β-bloqueadores y a la incidencia de la fibrilación auricular durante la terapia con los β-bloqueadores. El grado de disminución de LDL por las estatinas se ha relacionado con polimorfismos en HMG CoA reductasa, objetivo de las estatinas (véase capítulo 31). Los polimorfismos del canal iónico se han relacionado tanto por el gen candidato como por la secuenciación del exoma con el riesgo de arritmias cardiacas en presencia y ausencia de desencadenantes del fármaco (Kääb et al., 2012; Weeke et al., 2014).

Modificadores del medio biológico

El polimorfismo de MTHFR está relacionado con la homocisteinemia, que a su vez afecta el riesgo de trombosis. El riesgo de trombosis inducida por fármacos depende no sólo del uso de fármacos protrombóticos sino también de la predisposición genética y ambiental a la trombosis, que puede verse afectada por los polimorfismos de la línea germinal en MTHFR, factor V y protrombina. Estos polimorfismos no actúan directamente sobre la farmacocinética o la farmacodinámica de los fármacos protrombóticos como los glucocorticoides, los estrógenos y la asparaginasa, pero pueden modificar el riesgo del evento fenotípico (trombosis) en presencia del fármaco. Del mismo modo, los polimorfismos en los canales iónicos (p. ej., KCNQ1, KCNE1, KCNE2) que no son ellos mismos los objetivos de los fármacos que prolongan los intervalos QT pueden afectar la duración del intervalo QT basal y el riesgo global de arritmias cardiacas; esto a su vez puede aumentar el riesgo de arritmias QT largas vistas con antiarrítmicos y una serie de otros fármacos "no cardiovasculares" (p. ej., antibióticos macrólidos, antihistamínicos).

Cáncer como un caso especial

El cáncer parece ser una enfermedad de inestabilidad genómica. Además de la variación subyacente en la línea germinal del huésped, las células tumorales exhiben mutaciones somáticamente adquiridas, algunas de las cuales generan proteínas cinasas mutantes que son conductoras del desarrollo del cáncer. Por tanto, la secuenciación del tumor se está convirtiendo en una atención estándar para elegir entre los medicamentos contra el cáncer en ciertos entornos (véanse los capítulos 65-68).

Por ejemplo, los pacientes con cáncer de pulmón con mutaciones activadoras en EGFR, que codifica el receptor del factor de crecimiento epidérmico, muestran respuestas incrementadas al inhibidor de EGFR gefitinib (Maemondo et al., 2010). Por tanto, el EGFR está alterado, y los pacientes con la mutación activante tienen, en términos de tratamiento, una categoría farmacogenética distinta de cáncer de pulmón. El anticuerpo Her2 trastuzumab puede producir miocardiopatía en todos los pacientes expuestos. Los pacientes con cáncer de mama cuyos tumores expresan el antiácido Her2 pueden beneficiarse del trastuzumab, mientras que aquellas cuyos tumores no expresan Her2 no se benefician, pero sí son susceptibles a la miocardiopatía. De manera similar, sólo los pacientes con melanoma cuyos tumores expresan el mutante BRAF V600E responden a vemurafinib; curiosamente, vemurafinib también puede ser efectivo en otros tumores (cáncer de tiroides, leucemia de células pilosas) que expresan BRAF V600E. Algunas alteraciones genéticas afectan tanto al tumor como al huésped. La presencia de dos en lugar de tres copias de un polimorfismo de repetición del potenciador de TYMS no sólo aumenta el riesgo de toxicidad en el hospedero sino que también incrementa la posibilidad de susceptibilidad tumoral a los inhibidores de TYMS (Evans y McLeod, 2003).

La genómica como un camino para la identificación de nuevos objetivos farmacológicos

La identificación de las vías genéticas en la fisiología normal y en la disnea puede proporcionar pistas importantes para nuevos objetivos farmacológicos. Estudios seminales de pacientes con la rara enfermedad FH identificó HMG-CoA reductasa como la enzima clave limitante de la velocidad en la biosíntesis del colesterol LDL; ahora, los inhibidores de esa enzima (las estatinas) se encuentran entre los medicamentos más eficaces y ampliamente utilizados en la terapia cardiovascular (véase el capítulo 33). La PCSK9 contribuye a la degradación de los receptores de LDL, que son responsables de eliminar el colesterol LDL de la circulación; un aumento en la actividad de PCSK9 da como resultado la reducción de la función del receptor de LDL y un aumento en el colesterol LDL. Una causa rara de FH son las mutaciones de ganancia de función en PCSK9. Por el contrario, el trabajo en el Estudio del Corazón de Dallas (Dallas Heart Study), mostró que los individuos que portaban mutaciones sin sentido en la PCSK9 tenían valores de colesterol LDL más bajos y un menor riesgo de enfermedad arterial coronaria en comparación con los no portadores (Cohen et al., 2006). Este resultado, a su vez, identificó a la PCSK9 como un posible objetivo fármacológico. En 2015, dos anticuerpos cuyo objetivo era la PCSK9, alirocumab y evolocumab, fueron aprobados por la FDA para uso clínico en FH y otros trastornos de lípidos. Estos inhibidores de PCSK9 evitan la degradación de los receptores de LDL y mejoran su reciclaje en la membrana de los hepatocitos, lo que facilita la eliminación del colesterol LDL y la reducción de los niveles de colesterol LDL en la sangre (véase la figura 33-4).

De manera similar, nuevos objetivos farmacológicos han sido identificados por el trabajo que muestra que las variantes poco frecuentes de pérdida de función en APOC3 reducen los triglicéridos y el riesgo de enfermedad de la arteria coronaria (Stitziel et al., 2014) y la pérdida de las variantes funcionales en SLC30A8 reducen el riesgo de diabetes tipo 2 (Flannick et al., 2014). Los pacientes homocigotos para variantes de pérdida de función SCN9A son insensibles al dolor (Cox et al., 2006); los inhibidores de SCN9A podrían ser analgésicos útiles. Cientos de mutaciones en el transportador de cloruro codificadas por CFTR causan CF, pero a través de diversos mecanismos. El ivacaftor corrige parcialmente la activación anormal de ciertas variantes raras de CFTR (G551D y otros), mientras que el lumacaftor mejora la expresión de la superficie celular de la variante más común, ΔF508. El ivacaftor (Ramsey et al., 2011) y la combinación ivacaftor/lumacaftor (Wainwright et al., 2015) mejoran los síntomas y los resultados en pacientes con CF; ambos agentes han sido aprobados en pacientes genotipados.

La comprensión cada vez mayor de los contribuyentes genéticos a las acciones variables de los medicamentos plantea preguntas sobre cómo los proveedores de servicios de salud podrían utilizar estos datos para elegir entre los fármacos, las dosis y los regímenes de dosificación. Un enfoque es la prueba en el punto de atención, en la que el genotipo se ordena en el momento de la prescripción del medicamento; las plataformas que entregan de manera confiable los genotipos relevantes rápidamente (a menudo en menos de una hora) ahora hacen que estos enfoques sean factibles. Sin embargo, una dificultad en este enfoque es que cada medicamento requiere un ensayo por separado. Un enfoque alternativo prevé la determinación del genotipo en múltiples loci relevantes para las respuestas a grandes cantidades de fármacos, incorporando esta información en el EMR de cada paciente y utilizando el apoyo de las decisiones clínicas para asesorar sobre la selección y dosificación de los fármacos cuando se prescribe un fármaco relevante a un paciente con una variante genotípica. Este enfoque se está probando en varios sitios de "usuarios iniciales" (Pulley et al., 2012; Rasmussen-Torvik et al., 2014).

Hay varias barreras que deben abordarse si se adopta ampliamente este enfoque. En primer lugar, las pruebas que relacionan una variante con una respuesta farmacológica variable deben ser sólidas, el resultado variable debe ser clínicamente importante y debe proporcionarse alguna forma de consejo guiado genéticamente (elegir otro medicamento, elegir otra dosis, etc.). Los pares de genes de fármacos como CYP2C19*2/clopidogrel o CYP2C9*3/warfarina pueden clasificarse en esta categoría; el Consorcio de Implementación Farmacogenómica Clínica (Clinical Pharmacogenomics Implementation Consortium) proporciona directrices sobre dicho asesoramiento para múltiples fármacos por el genotipo (Relling y Klein, 2011). En segundo lugar, la fuerza de la evidencia que respalda una estrategia de prescripción específica del genotipo varía. El mayor nivel de evidencia proviene de los RCT, en los que se compara una estrategia de tratamiento guiada por un genotipo clínicamente importante con un estándar de atención. Usando este enfoque se ha demostrado que el genotipado para HLA-B5701 elimina el riesgo de reacciones cutáneas graves (como el síndrome de Stevens-Johnson) durante el tratamiento con el agente antirretroviral abacavir (Mallal et al., 2008). Varios ensayos han estudiado la utilidad del genotipo para las variantes de CYP2C9 y VKORC1 durante el tratamiento con warfarina. La medida del resultado principal ha sido la duración de la exposición al fármaco en el rango terapéutico durante los primeros 30-90 días de tratamiento; los resultados han sido inconsistentes, y ninguno muestra un gran efecto (Kimmel et al., 2013; Pirmohamed et al., 2013). Estos estudios tienen pocos episodios hemorrágicos, pero los estudios de casos y controles basados en EMR que examinan este problema han implicado variantes en CYP2C9 o CYP4F2 como los alelos de riesgo (Kawai et al., 2014; Roth et al., 2014). Los diseños de estudios no aleatorios son más débiles que los RCT, pero realizar un RCT para detectar subconjuntos pequeños de pacientes con variantes poco comunes puede no ser factible.

Reconocimiento

Mary V. Relling y Kathleen M. Giacomini contribuyeron a este capítulo en las últimas ediciones de este libro. Hemos conservado parte de su texto en la edición actual.