Capítulo C13: Diagnóstico de laboratorio en enfermedades infecciosas

Para diagnosticar una infección por medio de técnicas de laboratorio es necesario demostrar de manera directa o indirecta la presencia de virus, bacterias, hongos y parásitos en los tejidos, líquidos o excreciones del hospedador. Los laboratorios de microbiología clínica son los encargados de preparar las muestras y precisar la susceptibilidad de bacterias y hongos patógenos a los antibióticos. Por lo regular, la detección de microorganismos ha dependido en buena medida de su visualización microscópica en el material, o bien de la proliferación de los patógenos en medios de laboratorio. En términos generales, la identificación se ha basado en las características fenotípicas, como los perfiles de fermentación en el caso de las bacterias; los efectos citopáticos de los cultivos hísticos en busca de agentes virales; y la morfología microscópica de hongos y parásitos. Las técnicas son fiables, pero a menudo son lentas. El empleo de sondas a base de ácido nucleico se ha tornado cada vez más el método habitual de detección, cuantificación, identificación en el laboratorio de microbiología clínica y ha sustituido de manera gradual a la definición fenotípica y los métodos de visualización microscópica. En este capítulo se revisan los conceptos generales de las pruebas diagnósticas, con énfasis en la identificación de bacterias. En capítulos distintos se realiza una revisión más amplia de la detección de microorganismos virales, micóticos y parasitarios (cap. 185, 206, y 217, respectivamente).

Los microorganismos pueden detectarse por métodos manuales o automatizados, lo que depende de la presencia de moléculas singulares a patógenos específicos. Las moléculas útiles para la detección de microorganismos incluyen componentes estructurales de bacterias, hongos y virus; antígenos específicos; productos terminales del metabolismo; secuencias singulares de DNA o RNA; enzimas; toxinas u otras proteínas y polisacáridos de superficie. Éstas se detectan por diversos métodos, lo que incluye inmunofluorescencia, quimioluminiscencia para sondas de DNA/RNA, detección de ácidos grasos de cadena corta o larga por ionización en flama y detección del uso de sustratos o formación de productos terminales en la forma de cambios de coloración o de actividad enzimática como cambios en la absorbancia de la luz, cambios en la turbidez como medición de la proliferación bacteriana, de los efectos citopáticos en las líneas celulares y aglutinación de partículas como medición de la presencia de antígenos. La amplificación mejora la sensibilidad con la que pueden detectarse señales débiles. Un método de amplificación común es el crecimiento de un de una sola bacteria o levadura en una colonia visible en una placa de agar. La amplificación específica más rápida de señales biológicas se logra con técnicas como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, polymerase chain reaction); la reacción en cadena de la ligasa (LCR, ligase chain reaction); y la amplificación mediada por transcripción (TMA, transcription-mediated amplification), técnicas dirigidas de modo específico a DNA y RNA del patógeno; enzimoinmunoanálisis (EIA, enzyme immunossays) para antígenos y anticuerpos; amplificación electrónica (para técnica de cromatografía de gas y líquido); métodos de captura de anticuerpos (para concentración o separación, o ambas); y filtración y centrifugación selectiva.

La detección directa se refiere a la identificación de patógenos sin el uso de cultivos. Más adelante se revisan los métodos moleculares para la detección directa.

MICROSCOPIA Y TINCIÓN

El campo de la microbiología ha sido definido en gran medida por el desarrollo y uso del microscopio. El estudio de muestras por métodos de ese tipo permite contar a muy breve plazo con información diagnóstica útil. Es posible percibir con mayor claridad los microorganismos gracias a las técnicas de tinción.

El método más sencillo de valoración microscópica es la preparación húmeda, que se emplea por ejemplo para estudiar el líquido cefalorraquídeo (LCR) en busca de Cryptococcus neoformans, con tinta china que sirva como trasfondo contra el cual se delinean hongos con grandes cápsulas. Los preparados húmedos con iluminación de campo oscuro también se utilizan para detectar espiroquetas obtenidas de muestras de lesiones en genitales e identificar Borrelia o Leptospira en la sangre. Las muestras de piel obtenidas por raspadura y las de cabello se examinan en una preparación húmeda que utiliza hidróxido de potasio al 10% o el método de blanco de calcoflúor e iluminación ultravioleta para detectar elementos micóticos, a manera de estructuras fluorescentes. A menudo se usa la tinción de preparados húmedos para la identificación morfológica, por ejemplo la tinción azul de algodón con lactofenol en busca de elementos micóticos.

Las bacterias son difíciles de observar con microscopia de luz, a menos que se sometan a tinción. Aunque pueden emplearse métodos de tinción simple, en un solo paso, son más comunes las tinciones diferenciales.

Técnica de Gram

Por medio de la tinción de Gram se diferencia entre microorganismos con paredes de peptidoglucanos gruesas (grampositivos) y los que tienen dichas paredes pero delgadas y membrana externa que se disuelven con alcohol o acetona (gramnegativos). La morfología y las características de la tinción de Gram suelen usarse para clasificar en grupos a microorganismos teñidos, como estreptococos, estafilococos y clostridios (cuadro C13-1). La tinción de Gram es en particular útil para el estudio de esputo en busca de polimorfonucleares (PMN) y bacterias. Las muestras de esputo obtenidas de sujetos con buena función inmunitaria que tienen ≥ 25 polimorfonucleares y < 10 células epiteliales por campo de baja amplificación aportan por lo regular información clínica útil. Sin embargo, la presencia en muestras de "esputo" con > 10 células epiteliales por campo de baja potencia y de múltiples tipos bacterianos sugiere contaminación con la microflora de la boca. A pesar de las dificultades para discriminar entre la microflora normal y los patógenos, tiene utilidad recurrir a la tinción de Gram en el caso de muestras provenientes de zonas con gran microflora residente. La tinción de Gram de muestras de material vaginal obtenido con aplicador se emplea para identificar células epiteliales cubiertas con bacterias grampositivas, en ausencia de lactobacilos y presencia de bacilos gramnegativos, un signo considerado de vaginosis bacteriana. La detección de cocos gramnegativos en pares en pus obtenida del meato de un varón con disuria es diagnóstica de gonorrea.

El estudio de muestras obtenidas de sitios corporales normalmente estériles, como los líquidos cefalorraquídeo, sinovial, pleural o peritoneal mediante tinción de Gram tiene utilidad para identificar la presencia de bacterias, PMN o ambos. Su sensibilidad hace posible detectar incluso > 10⁴ bacterias/ml. Por lo regular, antes de la tinción se centrifuga la muestra para concentrarla cuando es posible que tenga un escaso número de microorganismos. El sencillo método anterior es en particular útil para el estudio del líquido cefalorraquídeo y reconocer bacterias y leucocitos o para el análisis del esputo e identificar micobacterias.

Tinción para acidorresistentes

Este tipo de tinción identifica bacterias acidorresistentes (AFB, acid-fast bacteria; micobacterias) por la retención de colorante carbol fucsina después de la disolución de un solvente ácido/orgánico. Las modificaciones de la técnica permiten diferenciar entre Actinomyces y Nocardia u otros microorganismos con la propiedad acidorresistente débil o parcial. La tinción para acidorresistentes se aplica al esputo, otros líquidos y muestras tisulares cuando se sospecha la presencia de especies de Mycobacterium. En el área de una sola extensión es posible detectar escasos AFB y por ello, incluso si la muestra se ha concentrado por centrifugación, es necesaria una gran experiencia analítica para identificar AFB de color rosa/rojo contra el fondo azul del colorante de contraste requiere de un ojo entrenado. Un método alternativo para la identificación de AFB es la tinción con auramina-rodamina fluorescente.

Tinciones con fluorocromo

Las tinciones de esta índole, como la que utiliza naranja de acridina, permiten identificar leucocitos, levaduras y bacterias en líquidos corporales. Los colorantes para cápsulas, flagelos y esporas se emplean para identificar o demostrar estructuras características.

Tinciones inmunofluorescentes

La técnica directa con anticuerpos inmunofluorescentes usa anticuerpos acoplados a un compuesto fluorescente (como la fluoresceína) dirigidos contra un blanco antigénico específico para visualizar los microorganismos. Si se analizan las muestras en condiciones apropiadas, el compuesto de fluoresceína absorbe luz ultravioleta y la refleja con una longitud de onda más alta, que es visible para el ojo humano. En la técnica indirecta de anticuerpos inmunofluorescentes, un anticuerpo sin marcar (objetivo o blanco) se une a un antígeno específico. A continuación, la muestra se tiñe con un anticuerpo marcado con fluoresceína, dirigida contra el anticuerpo blanco. Cada anticuerpo blanco sin marcar unido al antígeno apropiado tiene múltiples sitios de unión del segundo anticuerpo y por esta razón se intensifica la señal visual. La inmunofluorescencia se emplea para detectar antígenos virales (p. ej., citomegalovirus, virus del herpes simple y virus respiratorios) dentro de las células cultivadas o muestras clínicas, al igual que agentes bacterianos difíciles de cultivar (p. ej., Legionella pneumophila) en muestras clínicas.

Las técnicas de aglutinación con látex y las de enzimoinmunoanálisis son rápidas y baratas para identificar microorganismos, toxinas extracelulares y agentes virales por medio de antígenos proteínicos y polisacáridos. Dichos procedimientos se pueden realizar de manera directa en muestras clínicas o después de la proliferación de los microorganismos en placas de agar o cultivos para virus. Se utilizan anticuerpos unidos a un portador (como las partículas de látex o una enzima) para detectar las reacciones de unión de antígenos-anticuerpo.

La aglutinación directa de bacterias con anticuerpos específicos es sencilla pero relativamente insensible, lo cual mejora con métodos como la aglutinación en látex y los enzimoinmunoanálisis. Algunos antígenos celulares como los polisacáridos y lipopolisacáridos capsulares se reconocen por aglutinación de una suspensión de bacterias cuando se agrega al anticuerpo; este método es útil para tipificar los antígenos somáticos de Shigella y Salmonella. En los sistemas como los enzimoinmunoanálisis que utilizan anticuerpos acoplados a una enzima, la reacción antígeno-anticuerpo produce la conversión de un sustrato incoloro en un producto cromático. Muchas de éstos aportan información sobre la presencia del antígeno, pero no lo cuantifican. Los EIA son útiles para la detección de toxinas bacterianas, por ejemplo Escherichia coli productora de toxina shiga.

Los inmunoanálisis rápidos y sencillos de antígenos de Streptococcus del grupo A, virus de la gripe (influenza) y virus sincitial respiratorio se utilizan en el entorno clínico sin necesidad de un laboratorio diagnóstico especializado. Los resultados poseen una especificidad razonable, pero su sensibilidad es apenas mediana.

La medición de anticuerpos séricos proporciona un marcador indirecto de infección previa o actual con un virus u otro patógeno específicos, incluidos Brucella, Legionella, Rickettsia y Helicobacter pylori. Pueden utilizarse métodos serológicos para determinar si un individuo tiene concentraciones protectoras de anticuerpos, o bien si se encuentra infectado por un patógeno específico. La determinación de las concentraciones de anticuerpos como medida de la inmunidad actual es importante en el caso de agentes virales para los cuales existen vacunas, como el virus de la rubeola y el virus de la varicela-zóster; los análisis para este propósito utilizan casi siempre una o dos diluciones de suero para determinaciones cualitativas de las concentraciones protectoras de anticuerpos. Los estudios serológicos cuantitativos para identificar incrementos de los títulos de anticuerpos se emplean más a menudo junto con muestras de suero obtenidas al inicio de la enfermedad y 10 a 14 días más tarde (muestras de fase aguda y de la convalecencia). Como el periodo de incubación antes de la aparición de los síntomas puede ser lo suficientemente largo para la aparición de la respuesta de anticuerpos, la demostración de anticuerpos de fase aguda es suficiente con frecuencia para establecer el diagnóstico de infección activa, a diferencia de la exposición previa. Un incremento de cuatro veces de los títulos totales de anticuerpos entre las fases aguda y de convalecencia se considera evidencia de infección activa. Además, puede ser útil la medición de IgM en las fases tempranas y agudas de la respuesta de anticuerpos. Para ciertos agentes virales, como el virus de Epstein-Barr, los anticuerpos producidos pueden dirigirse a diferentes antígenos durante distintas fases de la infección. Por esta razón, la mayor parte de los laboratorios realiza pruebas para anticuerpos dirigidos contra antígenos de la cápside viral y antígenos relacionados con células del hospedador con infección reciente, con el fin de precisar la etapa de la infección.

OBTENCIÓN Y TRANSPORTE DE LA MUESTRA

Para el cultivo de bacterias, hongos y virus patógenos es necesario colocar la muestra idónea en un medio adecuado para que prolifere. Por lo general, la identificación de un patógeno específico depende de la obtención y el proceso de transporte, además de un algoritmo de preparación en el laboratorio idóneo para cada agente/muestra específico. En algunos casos es mejor inocular en placas las muestras en el momento de reunirse en vez de transportarlas al laboratorio (p. ej., muestra de uretra obtenida por aplicador cultivada para Neisseria gonorrhoeae). En términos generales, cuanto más pronto se realice la inoculación de la muestra en placas de medios adecuados, mayor será la posibilidad de aislar bacterias patógenas. Es muy posible que las muestras de tejidos o líquidos profundos (pus) suministren mejores resultados de los cultivos respecto de las muestras superficiales obtenidas con aplicadores. El cuadro C13-2 incluye métodos para reunir y transportar muestras comunes. Se han planteado innumerables paradigmas específicos de patógenos para cada procedimiento; por ello es importante buscar orientación del laboratorio de microbiología si alguna situación particular es dudosa.

AISLAMIENTO DE BACTERIAS PATÓGENAS

Aislar patógenos sospechados en el material clínico depende del uso de medios artificiales que inducen la proliferación bacteriana. Dichos medios están compuestos de agar; nutrientes; y, algunas veces, sustancias para inhibir la proliferación de otras bacterias. Los caldos se utilizan para la proliferación de microorganismos de muestras con escasas bacterias, como los líquidos de diálisis peritoneal o el cefalorraquídeo, o muestras que pueden contener anaerobios u otros microorganismos trofoespecíficos. Los caldos de cultivo que posibilitan la proliferación de pequeños números de microorganismos pueden subcultivarse en medios de cultivo sólidos una vez que se detecta la proliferación. No es adecuado el uso de medios líquidos para todas las muestras.

Se recurre a dos formas básicas para el aislamiento de bacterias patógenas. La primera consiste en emplear medios enriquecidos que sustentan el crecimiento de cualquier bacteria que puede estar presente en un sitio normalmente estéril, como la sangre o el líquido cefalorraquídeo. La segunda usa medios de cultivo selectivos para aislar bacterias específicas para muestras que contienen muchas bacterias que contiene una población compleja de bacterias (p. ej., heces o secreciones del aparato reproductor). Los antibióticos u otras sustancias inhibidoras se incorporan en el medio de agar para inhibir la proliferación de todas las bacterias, excepto las de interés. Después de la incubación, los microorganismos que proliferan en estos medios se definen con mayor detalle para determinar si son patógenos (fig. C13-1).

HEMOCULTIVO

La detección de patógenos microbianos en la sangre es difícil porque el número de microorganismos presentes en la muestra es a menudo demasiado bajo y la capacidad e integridad del patógeno para replicarse puede alterarse por los mecanismos de defensa humoral o fármacos antibióticos. Los sistemas de hemocultivo automatizados detectan la producción de gas (sobre todo CO₂) por bacterias o levaduras en proliferación en el caldo de una botella de hemocultivo. Como estas botellas están sometidas a vigilancia frecuente, muchas veces se identifica un cultivo positivo con mayor rapidez respecto de las técnicas manuales y puede obtenerse en menos tiempo información importante, lo cual incluye resultado de la tinción de Gram y los análisis preliminares de sensibilidad. Varios factores modifican los resultados de los hemocultivos en pacientes con bacteriemia. El incremento del volumen de sangre analizada eleva la posibilidad de un cultivo positivo. Por ejemplo, si el tamaño de una muestra aumenta de 10 a 20 ml, la proporción de cultivos positivos se incrementa en casi 30%, aunque este efecto es menos notorio en individuos con endocarditis bacteriana. Obtener múltiples muestras para cultivo (hasta tres en un periodo de 24 h) también incrementa la posibilidad de reconocer un patógeno bacteriano. Para los sistemas de hemocultivo automatizados no es necesario realizar cultivos prolongados y subcultivos a ciegas para la detección de bacterias de crecimiento lento (p. ej., microorganismos HACEK).

Los sistemas automatizados también se han aplicado a la detección de proliferación microbiana de muestras diferentes a la sangre, como líquido peritoneal u otros líquidos que en condiciones normales son estériles. Las bacterias del género Mycobacterium pueden reconocerse con el empleo de ciertos sistemas automatizados si se usan medios de cultivo apropiados. Aunque los sistemas de hemocultivo automatizado son más sensibles que los métodos de lisis-centrifugación (p. ej., Isolator) para levaduras y la mayor parte de las bacterias, se recomienda el cultivo con lisis-centrifugación para hongos filamentosos, Histoplasma capsulatum y algunas bacterias de crecimiento lento (Legionella y Bartonella).

Una vez aisladas las bacterias, se puede determinar la especie a que pertenecen por medio de las características detectables con facilidad después de su proliferación en medios de agar (tamaño y color de la colonia, reacciones hemolíticas, olor, aspecto microscópico), pero para identificarlas de manera definitiva se necesitan más estudios. Los métodos de identificación incluyen la fenotipificación bioquímica regular, que es aún el más común, y otros más complejos como la espectrometría de masas, la cromatografía de gas y los estudios de ácido nucleico (véase más adelante).

FENOTIPIFICACIÓN BIOQUÍMICA

La identificación habitual bioquímica del fenotipo de las bacterias supone la práctica de pruebas para reconocer antígenos proteínicos o carbohidratos; la producción de enzimas específicas; la capacidad de metabolizar sustratos específicos y fuentes de carbono (en la forma de carbohidratos); o la producción de algunos metabolitos. Se dispone de versiones rápidas de algunas de las pruebas y es posible identificar muchos de los microorganismos comunes desde el primer día de proliferación. Otros, en particular las bacterias gramnegativas, necesitan métodos más extensos, manuales o automatizados.

Los sistemas automatizados hacen posible la identificación fenotípica rápida de bacterias patógenas y muchos de ellos se basan en técnicas de biotipificación en los que se hace proliferar a los microorganismos aislados, en sustratos múltiples, y se comparan los perfiles de reacción con otros conocidos de diversas especies bacterianas. Este método es relativamente rápido. Entre los sistemas disponibles en el comercio se encuentran la fermentación miniaturizada, códigos para el registro más sencillo de resultados y cálculos de probabilidad de los agentes con mayor posibilidad de ser patógenos. Si la técnica de biotipificación es automatizada y el proceso de registro se acopla al análisis de datos por medio de computadora, es posible identificar a los microorganismos de proliferación rápida (como Enterobacterias) en término de horas tras su identificación en placas de agar.

Algunos sistemas utilizan sustratos para enzimas preformadas para la identificación en término de 2 a 3 h; tales sistemas no dependen de la proliferación bacteriana para establecer si se ha utilizado un sustrato. Emplean un inóculo abundante que posee enzimas bacterianas específicas en cantidades suficientes para transformar el sustrato con rapidez en el producto. Además, algunos sistemas usan métodos de detección de sustrato de fluorógeno/producto terminal para mejorar la sensibilidad por la amplificación de señales.

CROMATOGRAFÍA EN GAS-LÍQUIDO

Por lo regular, la técnica se utiliza para detectar productos metabólicos terminales de las fermentaciones bacterianas. Una aplicación común es la identificación de ácidos grasos de cadena corta producidos por anaerobios obligados durante la fermentación de la glucosa. Los tipos y las concentraciones relativas de ácidos volátiles difieren entre los géneros y las especies que componen a este grupo de microorganismos, razón por la cual dicha información sirve como una "huella dactilar" metabólica de un germen particular. La cromatografía de gas y líquido se puede acoplar a sistemas complejos de análisis de señales (software) para identificar y cuantificar ácidos grasos de cadena larga (LCFA, long-chain fatty acids) en la membrana externa y paredes de bacterias y hongos. Para cualquier especie particular, los tipos y concentraciones relativas de dichos ácidos tienen características singulares suficientes para permitir la diferenciación incluso de especies muy similares. Un microorganismo puede identificarse de manera definitiva en un lapso de horas después de detectar su proliferación en medios apropiados.

DESORCIÓN/IONIZACIÓN LÁSER ASISTIDA POR MATRIZ CON ESPECTROMETRÍA DE MASA DE DETECCIÓN DE IONES (MALDI-TOF).

MALDI-TOF (matrix-assisted laser disorption/ionization/time-of-flight mass spectrometry) es un método rápido y preciso para la identificación de microorganismos por análisis proteínico. Los microorganismos se mezclan con una matriz química, se secan en una placa y después se exponen a pulsos de rayo láser. El láser ioniza y vaporiza las proteínas microbianas, las cuales se transportan a través de una cámara de vacío cargada hacia un detector. El "tiempo de vuelo" hacia el detector se mide en cada una de las proteínas individuales y el patrón resultante se compara con un registro de patrones conocidos para diversos microorganismos con el fin de identificar al patógeno estudiado. Las moléculas primarias detectadas utilizando MALDI-TOF MS son las proteínas ribosómicas, que son las proteínas más abundantes en la célula.

La ventaja clínica principal de MALDI-TOF MS es que tarda sólo unos minutos en identificar un microorganismo directamente de una colonia sobre una placa de agar. Los métodos convencionales de identificación toman uno a tres días adicionales; MALDI-TOF tiene una elevada precisión para la identificación de la mayor parte de las bacterias y levaduras que crecen en agar sólido o en caldo para hemocultivo. Sin embargo, microorganismos menos comunes no se encuentran en las bases de datos aprobadas por la U. S. Food and Drug Administration (FDA) para los dispositivos de MALDI-TOF MS y estos microorganismos no pueden identificarse a menos que laboratorio utilice otra base de datos validada. MALDI-TOF MS se utiliza para la identificación de hifas de mohos en un número pequeño de laboratorios, pero no se encuentra ampliamente disponible. Debe notarse que MALDI-TOF no puede utilizarse a la fecha para diferenciar algunos microorganismos estrechamente relacionados, como Shigella y E. coli. Por tanto, deben utilizarse otros métodos para confirmar estas identificaciones. Otros usos potenciales de MALDI-TOF incluye el reconocimiento directo de bacterias y levaduras desde muestras clínicas (p. ej., orina), detección de la actividad de β lactamasa y tipificación de cepas de bacterias; sin embargo, estas aplicaciones aún se encuentran en desarrollo.

ESTUDIOS DE ÁCIDOS NUCLEICOS

Las técnicas para detectar y cuantificar secuencias de bases específicas de DNA y RNA en muestras clínicas se han transformado en instrumentos poderosos para el diagnóstico de infecciones por bacterias, virus, parásitos y hongos. Tales métodos se utilizan con cuatro finalidades. En primer lugar, se emplean para detectar y algunas veces cuantificar patógenos específicos en muestras clínicas. En segundo lugar, se usan para identificar microorganismos (casi siempre bacterias) difíciles de reconocer por métodos comunes. En tercer lugar, los estudios de este tipo se emplean para determinar si dos o más ejemplares del mismo patógeno tienen relación entre sí (es decir, si pertenecen al mismo "clon" o "cepa"). En cuarto lugar, se usan para anticipar la sensibilidad de los microorganismos a diversos productos quimioterapéuticos.

La tecnología actual comprende métodos de muy diverso tipo para amplificar y detectar señales y en Estados Unidos algunos de ellos han recibido aprobación de la FDA para el diagnóstico clínico. Muchos laboratorios han desarrollado sus propias pruebas de ácidos nucleicos para patógenos. Deben validarse rigurosamente antes de que pueden utilizarse para la atención de pacientes.

El empleo de estudios de ácidos nucleicos incluye por lo regular la lisis de bacterias o virus intactos y la desnaturalización de sus DNA o RNA hasta volverlos monocatenarios. Las sondas o los cebadores complementarios de la secuencia blanco específica del patógeno pueden hibridarse con la secuencia blanco en una solución o en un medio sólido, según sea el sistema utilizado. La hibridación in situ de una sonda con un blanco también es posible y permite utilizar las sondas con agentes en muestras hísticas. Una vez hibridados la sonda o el cebador con la secuencia blanco (señal biológica), es posible recurrir a diversas medidas para detectar, amplificar, cuantificar o realizar estas maniobras en el complejo ácido nucleico-sonda (fig. C13-2).

SONDAS PARA LA DETECCIÓN DIRECTA DE PATÓGENOS EN MUESTRAS CLÍNICAS

Las sondas de ácidos nucleicos se utilizan para el reconocimiento directo de patógenos en muestras clínicas sin la amplificación de la cadena blanco de DNA o RNA. Estas pruebas detectan una secuencia relativamente corta de bases específicas de un patógeno particular en DNA o RNA monocatenarios, por hibridación de una secuencia complementaria de bases (sondas), acoplado a un sistema "indicador" que actúa como señal para detectarse. En el comercio se pueden adquirir sondas de ácidos nucleicos para la identificación directa de bacterias y patógenos parásitos, incluidos Chlamydia trachomatis, N. gonorrhoeae y Streptococcus de grupo A. En Estados Unidos se ha aprobado una técnica combinada para detectar y diferenciar agentes de vaginitis/vaginosis (Gardnerella vaginalis, Trichomonas vaginalis y especies de Candida). Se dispone de sondas de diversos tipos para confirmar la identidad de patógenos cultivados, entre ellos algunos mohos dimórficos, especies de Mycobacterium y otras bacterias (como especies de Campylobacter, Streptococcus y Staphylococcus aureus). Las sondas para la detección directa de bacterias patógenas están diseñadas para secuencias de RNA ribosómicas 16S muy conservadas, de las cuales existen muchas más copias de las que se detectarían en cualquier secuencia aislada del DNA genómico en una bacteria. La sensibilidad y la especificidad de las sondas para detección directa son similares a las de métodos más comunes, como EIA y cultivo, Pero los análisis con sondas son menos sensibles que las pruebas de amplificación de ácidos nucleicos (NAAT, véase más adelante).

Otra técnica alternativa con sonda es la llamada captura híbrida, en la cual una sonda de RNA se hibrida con DNA blanco (destinatario); el híbrido de DNA/RNA resultante se captura en un medio sólido por un anticuerpo específico para ese tipo de híbridos (concentración/amplificación) y lo detecta un anticuerpo marcado con quimioluminiscencia específico para ese tipo de híbridos (DNA/RNA). Las técnicas de captura híbrida se pueden usar con C. trachomatis, N. gonorrhoeae y virus del papiloma humano.

MÉTODOS DE AMPLIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS (NAAT)

Existen varios métodos para la amplificación (copiado) de pequeñas cantidades de moléculas de ácidos nucleicos hasta concentraciones detectables con facilidad. Estas pruebas de amplificación de ácidos nucleicos (NAAT, nucleic acid amplification test) incluyen PCR, LCR, amplificación por desplazamiento de cadena, y réplica de secuencia autosostenida. En cada caso, la amplificación exponencial de las secuencias de DNA o RNA depende de los cebadores utilizados durante el calentamiento para favorecer la amplificación específica de la secuencia estudiada. El ácido nucleico amplificado se detecta después de la reacción y se completa o (en la detección de tiempo real) adapta a la amplificación según se lleve a cabo. La sensibilidad de NAAT es mayor que la de los métodos habituales, como el cultivo o sondas de ácidos nucleicos. La reacción en cadena de la polimerasa, que fue la primera NAAT y aún es la más practicada, comprende el calentamiento repetido del DNA para separar las dos cadenas complementarias de la doble hélice, la hibridación y la secuencia del cebador hasta la secuencia apropiada prefijada, la amplificación de esta última secuencia por medio de PCR para la extensión de la cadena complementaria, y la detección de señales por medio de una sonda marcada. Los métodos para la vigilancia seriada de PCR después de cada ciclo de amplificación (por incorporación de colorantes fluorescentes en DNA durante la extensión del cebador o el empleo de sondas fluorescentes capaces de transferir energía de resonancia de fluorescencia) han acortado el periodo necesario para reconocer una secuencia prefijada específica. Otro NAAT recurre a la amplificación mediada por transcripción en la cual la secuencia blanco de RNA se convierte en DNA que luego se transcribe de modo exponencial en una secuencia de RNA blanco. La ventaja de dicho método radica en que necesita una sola fase de calentamiento/hibridación para la amplificación.

La identificación de bacterias por lo demás difíciles de reconocer implica la amplificación inicial de una región del rDNA de 16S muy conservada en las mismas especies y en la secuenciación subsiguiente por medio de PCR. La definición de secuencias de 16S no es tan rápida en comparación con otros métodos, y aún es relativamente costosa para el empleo diario en un laboratorio de microbiología clínica, pero se ha vuelto el método definitivo para identificación de microorganismos poco comunes o difíciles de cultivar.

Pruebas de ácidos nucleicos metagenómicas y de siguiente generación

La secuenciación de siguiente generación se refiere a los métodos de alto rendimiento capaces de realizar la secuenciación de grandes números de moléculas de DNA en una mezcla compleja de secuencias. La secuenciación de siguiente generación ha hecho posible determinar con rapidez la secuencia de los carcinomas bacterianos y virales y detectar los ácidos nucleicos de los patógenos directamente en algunos tipos de muestras en seres humanos. Puede utilizarse la secuenciación del genoma entero de bacterias para la identificación del género y especie y potencialmente para predecir la susceptibilidad a los antibióticos; sin embargo, hay métodos más rápidos y menos costosos para estas aplicaciones. La secuenciación del genoma bacteriano entero con fines de tipificación, que cada vez es más práctico y de mayor utilidad, se revisa más adelante. Los análisis de una gran cantidad de secuencias de DNA presentes en una mezcla compleja de diferentes DNA, lo que se conoce como secuenciación metagenómica, puede utilizarse para detectar patógenos en algunos tejidos humanos. A causa del elevado nivel del DNA humano se dificulta la adquisición y análisis de datos y por tanto este método se ha aplicado principalmente a muestras de líquido cefalorraquídeo, que tiene relativamente poco DNA en comparación con otros tipos de muestras. Existen varios reportes de casos en los cuales se han utilizado pruebas metagenómicas para detectar bacterias y virus relacionadas con infecciones del CNS. Un pequeño número de laboratorios ofrecen secuenciación metagenómica para pruebas diagnósticas. Como éstas pruebas son costosas y lentas, es más probable que deban realizarse pruebas dirigidas para los patógenos más probables antes de considerar la secuenciación metagenómica.

PRUEBAS CUANTITATIVAS CON ÁCIDOS NUCLEICOS

Con el advenimiento de nuevos regímenes terapéuticos contra la enfermedad por VIH, la infección por los virus citomegálico y de hepatitis B y C, resultó necesario vigilar la respuesta a esta medida al conocer el genotipo y la "carga viral", es decir, el número de virus en varias fechas después del inicio del tratamiento. Se cuenta con NAAT cuantitativos para identificar VIH (PCR), virus citomegálicos (PCR) y virus de hepatitis B (PCR) y C (PCR y TMA). Muchos laboratorios han validado y realizan técnicas cuantitativas de los patógenos anteriores y otros más (como el virus de Epstein-Barr) y emplean reactivos con especificidad de analitos para NAAT.

La técnica de DNA complementario de cadena ramificada (bDNA) es una alternativa de los NAAT para la valoración cuantitativa de ácido nucleico. Con este método se une bDNA a un sitio diferente del de la secuencia de unión a la secuencia prefijada de la sonda original. En la siguiente fase, los oligonucleótidos marcados con quimioluminiscencia se ligan a múltiples secuencias repetitivas en bDNA. La señal amplificada de bDNA se detecta por quimioluminiscencia. En Estados Unidos, la FDA ha aprobado las técnicas de bDNA para carga viral en VIH y virus de hepatitis B y C. La ventaja de las técnicas de bDNA en relación con la PCR es que se necesita una sola fase de calentamiento/hibridación para lograr la hibridación de la sonda que se une al blanco con la secuencia prefijada para amplificación.

APLICACIÓN DE MÉTODOS DE ÁCIDOS NUCLEICOS

El número de NAAT aprobados por la FDA se ha incrementado de manera espectacular e incluye pruebas para Mycobacterium tuberculosis, N. gonorrhoeae, C. trachomatis, estreptococos del grupo B y S. aureus resistente a meticilina. La FDA ha aprobado paneles múltiples para NAAT que identifican a varios patógenos respiratorios y marcadores de resistencia limitada a los antibióticos. Tales estudios también se encuentran disponibles para hemocultivos positivos. Aunque el uso de estos paneles sindrómicos se ha incrementado en años recientes, aún debe resolverse varios problemas con respecto a su uso, lo que incluye que hacer cuando se detecta más de un objetivo de estudio. Muchos laboratorios han utilizado reactivos disponibles en el comercio y reactivos específicos para analitos con el fin de diseñar pruebas de laboratorio para uso diagnóstico. Las pruebas de ácidos nucleicos son útiles para detectar e identificar a patógenos bacterianos de difícil crecimiento que no pueden cultivarse, como Legionella, Ehrlichia, Rickettsia, Babesia, Borrelia y Tropheryma whipplei. Además, se han desarrollado métodos para la detección rápida de agentes infecciosos, motivo de preocupación de salud pública, para patógenos como Franciscella tularensis, Bacillus anthracis, virus de la viruela y Yersinia pestis; dichas pruebas están disponibles en los laboratorios regionales (estatales) y en los Centers for Disease Control and Prevention.

Las técnicas con ácidos nucleicos también se han usado para identificar la cercanía de la relación entre diferentes microorganismos de la misma especie del patógeno. La demostración de que las bacterias de un clon han infectado a múltiples pacientes en el contexto de un posible medio de transmisión (como un miembro del personal asistencial) aporta pruebas confirmatorias de un brote. La electroforesis en gel con campos pulsados es todavía la mejor norma para el análisis de las cepas bacterianas; con dicho método se utilizan las enzimas restrictivas que reconocen las raras secuencias de nucleótidos para digerir DNA bacteriano y el resultado son grandes fragmentos de este ácido nucleico. Los fragmentos se separan por electroforesis en gel con polaridad variable de la corriente electroforética y después se visualizan. Perfiles similares de bandas (es decir, diferencias en < 3 bandas) sugieren que diferentes bacterias muestran una relación cercana o clonal. Entre los métodos más sencillos de tipificación de la cepa figuran el establecimiento de secuencias de genes solos o múltiples, y la amplificación (basada en PCR) de secuencias repetitivas de DNA en el cromosoma bacteriano. Se han utilizado métodos de secuenciación del genoma bacteriano entero y se utiliza de manera sistemática en laboratorios de salud pública para vigilar brotes epidémicos de infecciones transmitidas por alimentos con Listeria monocytogenes. Este método probablemente se utilizará más para la tipificación de patógenos transmitidos por alimentos ya que representa el nuevo método ideal en el análisis de cepas bacterianas.

Entre las aplicaciones futuras de los métodos con ácidos nucleicos probablemente estarán la sustitución del cultivo para identificar muchos patógenos con la adición de la tecnología de microcircuito integrado (chip) de DNA/RNA en estado sólido, en que en un solo chip de silicón se detectan miles de secuencias de ácido nucleico particulares.

Una de las responsabilidades fundamentales del laboratorio de microbiología clínica consiste en determinar si los antibióticos inhiben las actividades de bacterias específicas. Los métodos de este tipo se utilizan en clínica asistencial y para vigilar problemas de control de infecciones como las de S. aureus resistente a meticilina o Enterococcus faecium resistente a vancomicina. Dos medidas son útiles. En primer lugar, se realizan pruebas fenotípicas, con exposición de aislados bacterianos a antibióticos por diversos métodos, con medición del efecto sobre el crecimiento del microorganismo. En segundo lugar, se realizan pruebas genotípicas para detectar la presencia de genes que corresponden a resistencia a antibióticos específicos. La primera es una valoración cualitativa de la susceptibilidad, en la cual se definen las respuestas en susceptibles, resistentes o intermedias. La categoría "susceptible, dependiente de la dosis" indica que el microorganismo es susceptible, pero que se requieren dosis más elevadas o administración más frecuente. El estudio anterior puede abarcar la colocación de discos de papel que contienen antibióticos en una superficie de agar inoculada con la cepa bacteriana por valorar (método de difusión de disco o de Kirby-Bauer), y medir las zonas de inhibición de proliferación después de incubación, o bien el uso de cultivos en caldo que contienen una concentración prefijada de un antibiótico (método del valor crítico). Los métodos se han calibrado de manera cuidadosa al compararlos con otros de tipo cuantitativo y la experiencia acumulada en humanos con cada antibiótico, y se han calculado de una especie y de otra las zonas de inhibición y los valores críticos. Pueden utilizarse pruebas fenotípicas para determinar la concentración más baja de antibiótico que inhibe el crecimiento bacteriano visible (concentración mínima inhibitoria, MIC).

Después que se ha determinado el MIC, si se subcultivan los tubos en que no se detecta proliferación o crecimiento, puede valorarse la concentración mínima de antibiótico necesaria para destruir 99.9% del inóculo inicial (concentración bactericida mínima o MBC [minimal bactericidal concentration]). La cifra de MIC puede servir para la interpretación de categorías: susceptible, resistente o intermedia. La prueba de susceptibilidad cuantitativa por la técnica de dilución en microcaldo es una versión miniaturizada de la técnica de dilución en caldo; para ello se utilizan microplacas; ello ha permitido la automatización y se utiliza a menudo en laboratorios clínicos comunes. El epsilómetro (prueba E), un método reciente para determinar la MIC, usa una tira absorbente con un gradiente conocido de concentraciones de antibióticos en toda su longitud. Cuando se coloca la tira en la superficie de una placa de agar sembrada con la cepa bacteriana por valorar, el antibiótico se difunde en el medio e inhibe la proliferación de las bacterias. Para algunos microorganismos, como los anaerobios obligados y algunos estreptococos hemolíticos β, casi nunca se practican de forma sistemática los métodos de susceptibilidad debido a la dificultad de proliferación de los microorganismos y la sensibilidad prevista de muchos de ellos a los antibióticos específicos.

Las pruebas genotípicas para resistencia los antibióticos son precisas sólo cuando es muy probable que unos cuantos genes causen resistencia a antibióticos específicos. Estas pruebas por lo general proporcionan resultados en uno o dos días antes que las pruebas fenotípicas. La FDA aprobó pruebas genotípicas para S. aureus resistente a meticilina, para Enterococcus resistente a vancomicina y para bacilos gramnegativos entéricos resistentes a carbapenémicos (p. ej., E. coli, Klebsiella). Estas pruebas encuentran disponibles para estudios aislados o como parte de análisis que detectan patógenos específicos en hemocultivos positivos.

El surgimiento de tantos agentes para tratar infecciones generales por levaduras y hongos aumentó la necesidad de contar con pruebas correspondientes a microorganismos individuales y así conocer su susceptibilidad a antimicóticos específicos.

En muchos laboratorios se realizan pruebas de susceptibilidad para hongos. Las recomendaciones actuales para interpretación de los resultados con hongos son específicos para la especie más que para el género.

La categoría "susceptible, dependiente de la dosis" (antes descrita) se utiliza para Candida glabrata con algunas MIC de fluconazol. Las pruebas de susceptibilidad con monos (hongos con hifas), como aquellos del género Aspergillus, permanecen como técnicamente difíciles, consumen tiempo y suelen realizarse en laboratorios comerciales o de referencia. Para la mayor parte de los antimicóticos, se reporta un MIC, pero para las equinocandinas se reportará una concentración mínima eficaz (MEC, minimum effective concentration). La MEC y la concentración más baja que causa cambios específicos en la morfología de los hongos y es más reproducible que la MIC. Los resultados de las pruebas de susceptibilidad de mohos suelen reportarse sin interpretación convencional como susceptibles, intermedios o resistentes. Puede reportarse un valor de referencia epidemiológico (ECV, epidemiologic cutoff value) para algunos resultados de pruebas de susceptibilidad antimicóticos. Los aislados con MIC o MEC por debajo del valor de ECV no deben utilizarse como única base para la selección del tratamiento.

Consúltense los capítulos 185 y 186.