40-11: Análisis de DNA

La inspección directa de los ácidos nucleicos (a menudo denominada “genética molecular” o “diagnóstico por DNA”) es una herramienta importante en varias áreas clínicas, como la oncología, las enfermedades infecciosas, el análisis forense y el estudio general de la fisiopatología. Un impacto importante ha sido el diagnóstico de los trastornos mendelianos. Hay pruebas moleculares disponibles para más de 3 000 afecciones hereditarias. Una vez que se ha demostrado que un gen en particular está defectuoso en una enfermedad determinada, la naturaleza de la mutación en un paciente puede determinarse secuenciando los nucleótidos de los exones codificadores y los sitios de empalme. Se pueden utilizar diversas técnicas para determinar si la misma mutación está presente en otros pacientes con el mismo trastorno. La heterogeneidad genética es tan extensa que la mayor parte de las afecciones mendelianas se asocian con numerosas mutaciones en un locus, o a menudo múltiples locus, que producen el mismo fenotipo. Las mutaciones en varios cientos de genes diferentes causan trastornos vitreorretinianos, como la retinitis pigmentosa, y los cambios en varias docenas de genes que provocan miocardiopatía hipertrófica familiar. Este hecho complica el diagnóstico por DNA de los pacientes y la detección de portadores de defectos en genes específicos.

Algunas enfermedades se asocian con relativamente pocas mutaciones o con una sola mutación de alta prevalencia. Por ejemplo, toda enfermedad drepanocítica se debe exactamente al mismo cambio de glutamato a valina en la posición 6 de la β-globina y esa sustitución se debe a un cambio de un nucleótido en el sexto codón del gen de β-globina. Pero esa uniformidad es la excepción. En la fibrosis quística, casi 70% de los heterocigotos de ascendencia del norte de Europa presentan una deleción idéntica de tres nucleótidos que causa la pérdida de un residuo de fenilalanina de una proteína transportadora de cloruro; sin embargo, el 30% restante de las mutaciones de esa proteína son diversas (se han descubierto varios miles), de modo que ninguna prueba de detección aislada detecte a todos los portadores de fibrosis quística.

En las publicaciones médicas aparecen regularmente revisiones del estado técnico actual del análisis de DNA. Los estudios de reacción en cadena de polimerasa (PCR, polymerase chain reaction) revolucionaron muchos aspectos de la biología molecular y el diagnóstico por DNA incluyó esa técnica. Si se conocen las secuencias de los 10 a 20 nucleótidos en los extremos de una región de DNA de interés (como una porción de un gen), se pueden sintetizar los “cebadores” complementarios para estas secuencias. Cuando incluso una pequeña cantidad de DNA de un paciente (p. ej., de unos cuantos leucocitos, células de la mucosa bucal o folículos pilosos) se combina con los cebadores en una mezcla de reacción que replica el DNA (y después de que se realicen varias docenas de ciclos), la región del DNA entre los cebadores se amplificará exponencialmente. Por ejemplo, la presencia de infección temprana por VIH se puede detectar después de la amplificación por PCR de una porción del genoma viral.

La velocidad de secuenciación del DNA se ha acelerado en gran medida y su costo ha disminuido con la llegada de la “secuenciación de última generación”. El objetivo ideal del análisis del DNA se definió hace más de una década como el “genoma humano con costo de 1 000 dólares” y ese punto de referencia se alcanzó en 2014. Por lo tanto, ya es factible para un investigador secuenciar solo las secuencias de codificación (secuenciación del exoma completo) o los 6 400 millones de pares base de nucleótidos de cualquier individuo determinado (secuenciación del genoma completo). Ahora resulta menos costoso secuenciar el exoma completo de una persona que secuenciar selectivamente todos los genes que se sabe que están involucrados en algunas afecciones, por ejemplo, la miocardiopatía hipertrófica. Almacenar e interpretar el conjunto de datos que surgen de la secuenciación de un genoma completo son tareas desalentadoras y costosas pero que probablemente se puede superar. Se han analizado todas las secuencias de decenas de miles de personas y algunas de las que se publican están disponibles gratuitamente en la Internet para su análisis. La mayoría de estos individuos han aceptado que se analicen públicamente las implicaciones clínicas de sus genomas. En 2011 se superó el esfuerzo internacional por secuenciar todos los genomas de al menos 1 000 individuos de diversos grupos étnicos. Reino Unido y Estados Unidos han establecido proyectos para secuenciar genomas de 100 000 y 1 millón de voluntarios, respectivamente y para correlacionar la variación genética con el estado de salud.

Cuando se descubre que la secuencia del gen particular de un paciente es diferente de la “normal”, se puede interpretar como benigna, probablemente benigna, probablemente patógena o patógena. Cualquiera de estas interpretaciones es útil desde el punto de vista clínico. Sin embargo, otra categoría de interpretaciones es la variante de significación desconocida para la que no se puede tomar ninguna decisión en ese momento. Esto es frustrante para el paciente, para la persona que ordenó la prueba y para el laboratorio. A menudo, la variante de importancia desconocida se reinterpretará algún tiempo después y es importante transmitir esta información al paciente.

El requisito básico para el uso de ácidos nucleicos en el diagnóstico de afecciones hereditarias específicas es que se disponga de una sonda para el gen en cuestión. La sonda puede ser una parte del gen real, una secuencia cercana al gen o solo unos cuantos nucleótidos en la mutación real. Cuanto más cerca esté la sonda de la mutación real, más precisa y útil será la información obtenida. El diagnóstico con DNA incluye uno de los dos métodos generales: 1) detección directa de la mutación o 2) análisis de vinculación, mediante el cual la presencia de una mutación se deduce de la naturaleza de una secuencia de DNA de sonda distante de la mutación. En este último método, a medida que la sonda se aleja más de la mutación, aumentan las posibilidades de que la recombinación haya separado las dos secuencias y que confunda la interpretación de los datos.

El diagnóstico con DNA está encontrando una aplicación frecuente en la detección presintomática de individuos con trastornos dependientes de la edad, como la enfermedad de Huntington y la enfermedad poliquística renal del adulto, la detección de portadores de afecciones autosómicas recesivas como fibrosis quística y talasemias, exámenes de detección de mujeres heterocigotas de afecciones ligadas al cromosoma X como la distrofia muscular de Duchenne y la hemofilia A y B, y diagnóstico prenatal. Para algunas enfermedades en las que se producen complicaciones graves en la adolescencia o la edad adulta temprana, como el síndrome de von Hippel—Lindau, la telangiectasia hemorrágica hereditaria y las pruebas genéticas de poliposis colónica familiar a una edad temprana pueden identificar a los familiares que necesitan vigilancia clínica frecuente y tratamiento profiláctico; casi igual de importante, los familiares que dan negativo para la mutación pueden evitarse las molestias, los costos y el riesgo de la realización de pruebas clínicas. En todos los casos de pruebas de DNA, los médicos de atención primaria y los especialistas por igual deben tener en cuenta que siguen sin resolverse las cuestiones éticas, psicológicas, jurídicas y sociales sustantivas. Por ejemplo, a la fecha no se cuenta con un tratamiento eficaz para algunos trastornos para los que se puede definir fácilmente la susceptibilidad hereditaria (como la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Huntington y muchos cánceres). Para estas mismas alteraciones, las compañías aseguradoras de salud y de vida pueden estar especialmente interesadas en saber cuáles de sus clientes actuales o potenciales está en mayor riesgo. Muchos estados han promulgado legislación para proteger a las personas identificadas con mayor riesgo genético de alguna enfermedad. La Genetic Information Nondiscrimination Act (GINA) prohíbe la discriminación injusta en el seguro médico y el empleo. Las protecciones se limitan a aquellas personas en las que se detecta una susceptibilidad genética para una enfermedad que no es evidente en la clínica. Es importante destacar que en Estados Unidos la Affordable Care Act proporciona protección a todas las personas con enfermedades preexistentes.

Varias firmas comerciales ofrecen genotipos específicos o extensos a cualquier persona que presente una muestra de saliva y que pague una tarifa. Algunas de las razones sugeridas para hacerlo incluyen la identificación de los antecedentes en ancestros, la certificación de relaciones y, más a menudo, la detección de susceptibilidad genética a las enfermedades. Estos últimos se basan casi en su totalidad en estudios de asociación genómica amplia (GWAS) que han asociado polimorfismos de un solo nucleótido específico con una probabilidad mayor (o disminuida) de desarrollar una enfermedad común en particular. En casi todos estos análisis basados en la GWAS, la asociación con la enfermedad es muy significativa desde el punto de vista estadístico, pero tiene un valor predictivo notablemente bajo. En otras palabras, el riesgo relativo de desarrollar una enfermedad con base en uno de estos marcadores suele estar en el rango de 1.2 a 1.4. Prácticamente no se ha realizado ninguna investigación para examinar la utilidad clínica de ser identificado como uno de estos marcadores de riesgo. Por ejemplo, ¿hay alguien con un polimorfismo de un solo nucleótido vinculado al 9p21 que no tiene ninguna función biológica conocida pero que está asociada a un riesgo ligeramente mayor de desarrollar una afección relacionada con la aterosclerosis con mayor probabilidad de alterar su estilo de vida, cambiar su dieta o suspender el tabaquismo? También hay esfuerzos de comercialización dirigida al consumidor para pruebas genéticas específicas que debe ordenar el médico de una persona, como aquellas que sugieren que cualquier mujer con antecedentes familiares de cáncer de mama deben considerarse someterse a pruebas de mutaciones para BRCA1 y BRCA2.

Los linfocitos son una fuente de DNA de fácil acceso; 10 mL de sangre entera producen hasta 0.5 mg de DNA, suficiente para decenas de análisis, cada uno de los cuales requiere solo 5 mcg. Una vez aislada, la muestra de DNA se puede dividir en alícuotas y congelarse. Alternativamente, los linfocitos se pueden transformar en linfoblastos por medio de virus; estas células son inmortales, se pueden congelar y, siempre que se requiera DNA, se pueden descongelar, reproducirlas y aislar su DNA. Estas muestras almacenadas proporcionan acceso al genoma de una persona mucho después de la muerte del individuo. Esta es una ventaja tan importante que muchos centros de genética clínica y laboratorios comerciales almacenan el DNA de los pacientes y familiares, incluso si las muestras no se pueden utilizar de inmediato. Más tarde, las muestras pueden resultar muy útiles para los familiares o para otros pacientes estudiados. En algunos casos, el DNA se ha vuelto más fiable que los expedientes médicos. Sin embargo, en la práctica clínica habitual el análisis suele centrarse en uno o varios genes (como en un estudio familiar, en el que solo se aborda un cambio específico de nucleótidos). La cantidad de DNA necesaria es bastante pequeña: es adecuado contar con unos cuantos folículos pilosos o espermatozoides. La fuente más sencilla es la saliva (20 a 30 mL) o un raspado de la mucosa bucal.

El DNA fetal se puede aislar de las células amnióticas, de células trofoblásticas tomadas mediante muestreo de vellosidades coriónicas o de cualquier tipo celular cultivado. Las muestras deben procesarse con prontitud, pero pueden enviarse por correo nocturno y no deben congelarse.

Los fragmentos de DNA fetal también circulan en la sangre materna. El análisis de estos fragmentos permite un diagnóstico muy sensible y específico de la trisomía fetal de una manera mucho menos invasiva que a través de la amniocentesis.