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La propagación e identificación del agente infeccioso in vitro suele ser el medio más sensible y específico de diagnóstico y, por ende, es el método más comúnmente utilizado. En teoría, la presencia de un solo organismo vivo en la muestra puede arrojar un resultado positivo. La mayoría de las bacterias y hongos pueden cultivarse en una variedad de medios artificiales, pero a los microorganismos intracelulares estrictos (p. ej., Chlamydia, Rickettsia y virus) sólo es posible aislarlos en cultivos de células eucariotas vivas. Es posible cultivar algunos parásitos, pero esto se lleva a cabo sólo en laboratorios altamente especializados.
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Aislamiento de bacterias y hongos
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Casi todas las bacterias de importancia médica se pueden desarrollar fuera del hospedador en medios de cultivo artificiales. Una sola bacteria colocada en las condiciones de cultivo apropiadas se multiplicará en cantidades suficientes para que se perciban a simple vista. Los medios bacteriológicos son recetas similares a sopas preparadas a partir de digeridos de proteínas animales o vegetales suplementados con nutrientes como glucosa, extracto de levadura, suero o sangre para satisfacer los requisitos metabólicos del organismo. Su composición química es compleja y su éxito depende de que cumplan con los requisitos nutricionales de la mayoría de los seres vivos heterótrofos. Los mismos enfoques y algunos de los mismos medios de cultivo que se utilizan para las bacterias también se usan en el caso de los hongos.
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Las bacterias crecen en medios similares a una sopa.
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La propagación en medios preparados en estado líquido (caldos) es evidente cuando el número de bacterias es suficiente para producir turbidez o aglutinaciones macroscópicas. La turbidez es el resultado de la cantidad de luz que se refleja de las bacterias; dependiendo del tamaño del organismo, se requiere de más de 106 bacterias por mililitro de caldo. La adición de un agente gelificante a un caldo de cultivo permite su preparación en sólido en forma de placas en cajas de Petri. El agente gelificante universal para la bacteriología diagnóstica es el agar-agar, un polisacárido que se extrae de algas marinas. El agar-agar es conveniente en cuanto a que se licua a cerca de 95 °C, pero no retorna a un estado de gel sólido hasta que se enfría a menos de 50 °C, lo que permite añadir al cultivo sustancias lábiles al calor, como sangre, antes de que gelifique. A las temperaturas que se utilizan en el laboratorio diagnóstico (37 °C o menos) el agar-agar existe como un gel nutritivo liso y sólido. Este medio, normalmente denominado “agar”, puede calificarse con la descripción de cualquier suplemento que contenga (p. ej., agar sangre).
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Los grandes números de bacterias en un caldo de cultivo producen turbidez.
El agar es un agente gelificante universal conveniente para cultivos sólidos.
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Una útil característica de las placas de agar es que las bacterias pueden separarse al extender una pequeña muestra del producto biológico sobre su superficie. Las células bacterianas bien separadas de las demás crecen en colonias aisladas que a menudo alcanzan los 2 a 3 mm de diámetro después de incubarse durante la noche, lo que permite aislar las bacterias en un cultivo puro porque se asume que la colonia ha surgido a partir de un solo organismo (figura 4–7). Las colonias varían enormemente en cuanto a su tamaño, forma, textura, color y otras características denominadas morfología de la colonia. Las colonias de diferentes especies o géneros a menudo difieren en forma sustancial, mientras que aquellas derivadas de la misma cepa suelen ser consistentes. Las diferencias en la morfología de la colonia son de gran utilidad para separar a las bacterias dentro de una mezcla y para obtener pistas en cuanto a su identidad. En la figura 4–8 se muestran algunos ejemplos de morfología de la colonia.
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Es posible separar a las bacterias en colonias aisladas en placas de agar.
Las colonias pueden tener características consistentes y distintivas.
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También se utilizan nuevos métodos que no dependen de los cambios visuales en el medio de cultivo o en la formación de colonias para detectar la propagación bacteriana en un cultivo; estas técnicas incluyen los cambios ópticos, químicos y eléctricos que se producen en el medio a causa del número creciente de células bacterianas o de sus productos metabólicos. Muchos de estos métodos son más sensibles que las técnicas clásicas y, por ende, detectan la propagación horas o, incluso, días antes que los métodos tradicionales. Algunos también se han rediseñado en cuanto a instrumentación y automatización; por ejemplo, un sistema totalmente automatizado que detecta el metabolismo bacteriano por fluorometría permite llevar a cabo una identificación bacteriana y una prueba de susceptibilidad antimicrobiana en 2 a 4 horas.
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El crecimiento se detecta por medio de métodos ópticos, químicos y eléctricos.
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A lo largo de los últimos 100 años, los microbiólogos han desarrollado incontables medios auxiliares para el aislamiento e identificación de bacterias y hongos de importancia médica. Sólo unos cuantos han llegado a utilizarse en forma rutinaria en los laboratorios clínicos y es factible clasificarlos como medios nutritivos, selectivos o indicadores.
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El componente nutritivo de un medio está diseñado para satisfacer los requisitos de crecimiento del organismo a fin de permitir su aislamiento y propagación; para propósitos médicos, el medio ideal permitiría el crecimiento rápido de todos los agentes. No existe tal medio; sin embargo, existen varios que son suficientes para la propagación adecuada de la mayoría de las bacterias y hongos de importancia médica. Estos medios se preparan con los productos digeridos enzimáticos o ácidos de productos animales o vegetales como músculos, leche o soya. El digerido reduce la proteína original a una mezcla de polipéptidos y aminoácidos que también incluye metales traza, coenzimas y diversos factores de crecimiento indefinidos; por ejemplo, un caldo común contiene un digerido pancreático de caseína (proteína láctea) y un digerido papaico de harina de soya. Una opción es añadir sales, vitaminas o líquidos corporales como suero a esta base nutritiva, a fin de proporcionar a los patógenos las condiciones necesarias para su desarrollo óptimo.
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Los medios se preparan a partir de productos animales o vegetales.
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Los medios selectivos se usan cuando microorganismos patógenos específicos se buscan en sitios con una microbiota extensa (p. ej., especies de Campylobacter en especímenes de heces). En estos casos, las demás bacterias pueden desarrollarse más que la especie etiológica sospechada en un medio nutritivo sencillo, ya sea porque el patógeno crece más lentamente o porque se presenta en cantidades mucho más pequeñas. Por lo general, los medios selectivos contienen pigmentos, otros aditivos químicos o agentes antimicrobianos en concentraciones diseñadas para inhibir la flora contaminante pero no el patógeno sospechado.
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Los organismos indeseados se inhiben con químicos o antimicrobianos.
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Los medios indicadores contienen sustancias diseñadas para mostrar las características bioquímicas o únicas de otro tipo de patógenos o grupos de organismos. A menudo se utiliza la adición de uno o más carbohidratos y un indicador de pH al medio. Un cambio de color en la colonia indica la presencia de productos ácidos y, por ende, de fermentación u oxidación del hidrato de carbono por parte del organismo. Añadir eritrocitos a las placas permite que se utilice la hemólisis que producen algunos organismos como característica de diferenciación. En la práctica, es frecuente que se combinen las propiedades nutritivas, selectivas e indicadoras a diversos grados dentro de un mismo medio. Es posible incluir un sistema indicador dentro de un medio altamente nutritivo y también hacerlo selectivo al añadir los antimicrobianos adecuados. Algunos ejemplos de los medios de cultivo que por lo común se utilizan en la microbiología diagnóstica se listan en el apéndice 4–1 y se ofrecen más detalles de su composición y aplicación en el apéndice 4–2.
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Las propiedades metabólicas de las bacterias se exhiben mediante sistemas de sustrato e indicación.
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Condiciones atmosféricas
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Una vez inoculados, los cultivos de la mayoría de las bacterias anaerobias se colocan en una incubadora con una temperatura constante entre 35 y 37 °C. En ocasiones, se utilizan temperaturas ligeramente mayores o menores para favorecer un cierto organismo o grupo de organismos en forma selectiva. La mayoría de las bacterias que no son anaerobias obligadas crecen en el aire; sin embargo, algunas requieren de CO2 y el mismo compuesto potencia el crecimiento de otras. Las incubadoras que mantienen una concentración de 2 a 5% de CO2 en el aire se utilizan con frecuencia para el aislamiento primario porque este nivel no es dañino para ningún tipo de bacteria y mejora el aislamiento de algunas. Un método más sencillo es el del frasco con vela, en el cual se permite que una vela permanezca encendida hasta que se consuma en un frasco sellado que contenga placas; este método añade 1 a 2% de CO2 a la atmósfera. Algunas bacterias (p. ej., Campylobacter) requieren una atmósfera microaerofílica con concentración reducida de oxígeno (5%) y aumentada de CO2 (10%) para crecer. Lo anterior se puede alcanzar al usar un paquete disponible en el comercio que se coloca en un frasco que a continuación se sella de manera similar al sistema anaeróbico descrito más adelante.
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La temperatura y atmósfera de incubación varían según el organismo.
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Las bacterias estrictamente anaerobias no crecen bajo las condiciones antes descritas y muchas mueren al verse expuestas al oxígeno atmosférico o a altos potenciales de oxidorreducción. La mayoría de los anaerobios de importancia médica crecen en las profundidades de medios líquidos o semisólidos que contienen cualquier variedad de agentes reductores, como cisteína, tioglucolato, ácido ascórbico o, incluso, limaduras de hierro. Es posible lograr un ambiente anaeróbico para la incubación de las placas al reemplazar el aire con una mezcla de gases que contenga hidrógeno, CO2 y nitrógeno, y permitiendo que el hidrógeno reaccione con el oxígeno residual en un catalizador para que forme agua. Un sistema comercial conveniente logra esto en forma química en un paquete al que se le añade agua antes de sellar el frasco. Las muestras que se sospeche contienen números significativos de anaerobios deben procesarse bajo condiciones diseñadas para minimizar la exposición al oxígeno atmosférico en toda etapa.
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Los anaerobios requieren de condiciones de reducción y protección del oxígeno.
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Sistemas de microbiología clínica
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Se requieren sistemas de rutina en el laboratorio para procesar muestras provenientes de diversos sitios porque no existe un solo medio o atmósfera que sea ideal para todas las bacterias. Las combinaciones de caldos y placas sólidas, así como de incubación aeróbica, en CO2 y anaeróbica, deben ajustarse según los organismos esperados para cualquier localización o circunstancia clínica particular. El cuadro 4–1 muestra ejemplos de este tipo de rutinas. En general, no resulta práctico incluir medios especializados para el aislamiento de organismos inusuales como Corynebacterium diphtheriae o Legionella pneumophila; para la detección de esos y otros organismos poco comunes es necesario que el médico informe al laboratorio puntualmente en cuanto a la posibilidad de su presencia. Entonces, se pueden incluir medios y procedimientos especiales.
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Los sistemas de rutina están diseñados para detectar los organismos más comunes.
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Cuando se detecta crecimiento en cualquier medio, comienza el proceso de identificación, lo que comprende métodos para obtener cultivos puros a partir de colonias únicas, seguidos por pruebas diseñadas para caracterizar el aislado e identificarlo. Las pruebas exactas y sus secuencias varían con diferentes grupos de microorganismos, y el nivel taxonómico (género, especie, subespecie, etcétera) de identificación necesario varía de acuerdo con la utilidad médica de la información. En algunos casos, sólo es importante una descripción general o la exclusión de microorganismos particulares; por ejemplo, un informe de “flora oral mixta” en un espécimen de esputo o “no se aisló Salmonella, Shigella ni Campylobacter” en un espécimen de heces en ocasiones proporciona toda la información necesaria. La espectrometría de masas MALDI-TOF (desorción-ionización láser asistida por matriz-tiempo de vuelo, matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight) se ha convertido en una importante herramienta nueva usada para la identificación rápida de microorganismos ya aislados en cultivo puro; complementa los métodos tradicionales, pero no anula por completo la necesidad de esos métodos.
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El nivel de identificación se relaciona con su pertinencia médica.
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Características que se utilizan para la clasificación de bacterias y hongos
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Características culturales
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Las características culturales incluyen la demostración de propiedades, como los requisitos nutricionales únicos, producción de pigmento y capacidad de crecer en presencia de ciertas sustancias (cloruro de sodio, bilis) o en ciertos medios (agar MacConkey, nutritivo). También se utiliza un análisis de la capacidad de desarrollo a ciertas temperaturas o de ocasionar hemólisis en placas de agar sangre. En el caso de los hongos, la proliferación como colonia de levaduras o moho es el separador primario; en el caso de los mohos, la morfología de las estructuras del moho (hifas, conidios, etc.) es el medio principal de identificación.
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El crecimiento bajo condiciones diversas tiene un valor diferencial.
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Características bioquímicas
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La capacidad de atacar diversos sustratos o de fabricar productos metabólicos particulares tiene una amplia aplicación para la identificación de bacterias y levaduras. Las propiedades más comunes que se analizan se comentan en el apéndice 4–3. Las pruebas bioquímicas y de cultivo para la identificación bacteriana se analizan por referencia a cuadros que muestran los patrones de reacción característicos de especies individuales; de hecho, los avances en el análisis computarizado se han aplicado en la actualidad a la identificación de muchos grupos bacterianos y fúngicos. Estos sistemas utilizan los mismos principios bioquímicos junto con bases de datos computarizadas a fin de determinar la identificación más probable a partir de los patrones de prueba observados.
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Las reacciones bioquímicas analizadas mediante tabletas y computadoras proporcionan una probable identificación.
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Producción de toxina y patogenicidad
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Rara vez se necesita evidencia directa de virulencia en animales de laboratorio para confirmar un diagnóstico clínico. En algunas enfermedades causadas por la producción de una toxina específica, la toxina se puede detectar in vitro por medio de cultivos de células o métodos inmunológicos. La neutralización del efecto tóxico con antitoxina específica es el método habitual para identificar la toxina. Las pruebas para toxina sólo se efectúan en laboratorios especializados; se han desarrollado valoraciones moleculares para algunas toxinas.
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La detección de una toxina específica puede definir la enfermedad.
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Estructura antigénica
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Los virus, las bacterias, los hongos y los parásitos poseen muchos antígenos, como polisacáridos capsulares, proteínas de superficie y componentes de la pared celular. El estudio serológico comprende el uso de anticuerpos de especificidad conocida para detectar antígenos presentes en organismos enteros o libres en extractos (antígenos solubles). Los métodos usados para demostrar reacciones de antígeno-anticuerpo se comentan en “Detección de anticuerpos (estudio serológico)”.
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Estructuras antigénicas del organismo demostradas con antisueros.
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La relación de secuencia de ácido nucleico según se determina mediante comparaciones de homología y de secuencia directa se ha convertido en un determinante primario de las decisiones taxonómicas. Se comentan más adelante en la sección sobre métodos con ácido nucleico.
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Aislamiento e identificación de virus
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Cultivos de células y órganos
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Los cultivos de células vivas capaces de sustentar su replicación son los medios principales para el aislamiento de virus patogénicos. Las células se derivan de una fuente de tejidos mediante la proliferación celular a partir de un fragmento de tejido (explante) o por la dispersión de agentes proteolíticos como la tripsina. Se les permite crecer en un medio nutritivo sobre una superficie de vidrio o plástico hasta que se obtiene una capa confluente de una célula de espesor (monocapa). En algunas circunstancias se realiza un cultivo in vitro de un fragmento de tejido con una función especializada (p. ej., tráquea fetal con células epiteliales ciliadas) que se utiliza para la detección viral; este procedimiento se conoce como cultivo de órganos.
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Se utilizan cultivos celulares derivados de tejidos humanos o animales para aislar los virus.
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En la virología diagnóstica se utilizan tres tipos básicos de monocapas de cultivos celulares. El cultivo celular primario, en el que todas las células tienen un conteo cromosómico normal (diploide), se deriva del crecimiento inicial de células de una fuente de tejido. Una segunda dispersión y propagación producen el cultivo celular secundario, que por lo normal retiene características similares a aquellas del cultivo primario (cuenta cromosómica diploide y susceptibilidad a virus). Las células renales embrionarias de monos y humanos son ejemplos de cultivos celulares primarios y secundarios de uso común.
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Se utiliza el riñón de mono en los cultivos primarios y secundarios.
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Las dispersiones y cultivos posteriores de los cultivos celulares secundarios por lo general conducen a uno de dos resultados: las células mueren con el tiempo o pasan por una transformación espontánea en la que cambian las características del desarrollo, varía la cuenta cromosómica (haploide o heteroploide) y difiere la susceptibilidad a la infección vírica en contraste con el cultivo original. Estos cultivos celulares tienen características de “inmortalidad”; es decir, pueden volver a dispersarse y cultivarse en diversas ocasiones (pases seriados de cultivos celulares). También pueden obtenerse a partir de células de tejido canceroso o producirse mediante exposición a agentes mutagénicos in vitro. Tales cultivos se conocen comúnmente como líneas celulares. Una línea celular de uso diagnóstico común es la Hep-2, derivada de un carcinoma epitelial humano. Un tercer tipo de cultivo a menudo se denomina cepa celular; este cultivo consiste en células diploides, a menudo fibroblásticas, que pueden volver a dispersarse y cultivarse un número finito de veces, por lo general pueden hacerse 30 a 40 pases del cultivo celular antes de que la cepa se agote o presente transformaciones espontáneas. La amígdala y los fibroblastos pulmonares embrionarios de humano son cepas de células comunes usadas en laboratorios de virología clínica donde aún se efectúan cultivos. Las valoraciones moleculares que son más rápidas, más sensibles y más rentables, han reemplazado a las técnicas de cultivo viral estándar en muchos laboratorios.
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Las cepas celulares vuelven a propagarse un número limitado de veces.
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Se han desarrollado técnicas de detección de antígenos en cultivo (shell vial) con el uso de cubreobjetos con monocapas de líneas de células para algunos virus (p. ej., citomegalovirus, virus respiratorios), a fin de proporcionar un método de cultivo más rápido. El virus se amplifica en los viales para cultivo de células después de centrifugación a baja velocidad. A continuación se usan técnicas de tinción fluorescentes con el uso de anticuerpos monoclonales para el virus específico, a fin de detectar antígenos virales tempranos antes de la aparición del efecto citopático (CPE, cytopathic effect).
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Los cultivos primarios se agotan o se transforman.
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Las células provenientes de tejido canceroso pueden crecer de manera continua
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Detección del desarrollo viral
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El desarrollo viral en cultivos celulares susceptibles se detecta de diversas maneras. El efecto más común se observa en el caso de virus líticos o citopáticos; a medida que se replican dentro de las células, producen alteraciones en la morfología celular (o muerte celular), que se puede observar en forma directa por microscopia óptica a aumentos bajos (30× o 100×). Dicho efecto citopático (CPE) varía con diferentes virus en cultivos celulares distintos; por ejemplo, es frecuente que los enterovirus produzcan células redondeadas, pleomorfismo y posterior muerte celular en diversos sistemas de cultivo, mientras que el sarampión y los virus respiratorios sincitiales ocasionan la fusión celular para producir células gigantes multinucleares (sincitios). La apariencia microscópica de algunos cultivos celulares normales y el CPE que distintos virus producen en los mismos se ilustran en la figura 4–9.
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El CPE viral se debe a cambios morfológicos o muerte celular.
El CPE es característico para algunos virus.
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Otros virus se pueden detectar en un cultivo celular a causa de su capacidad para producir hemaglutininas; es posible que estas hemaglutininas se encuentren en las membranas de las células infectadas, así como en el medio de cultivo, como resultado de la liberación de viriones hemaglutinantes provenientes de estas células. La adición de hematíes al cultivo celular infectado ocasiona su adherencia a las superficies celulares, fenómeno conocido como hemadsorción. Otro método de detección viral en cultivos celulares es la interferencia. En esta situación, el virus que infecta al cultivo celular susceptible no produce un CPE ni hemaglutinina, pero se puede detectar al “desafiar” al cultivo celular con un virus distinto que normalmente produce un CPE característico. El segundo virus, o virus de desafío, no infecta al cultivo celular a causa de la interferencia producida por el primer virus, que entonces se detecta. Es evidente que este método resulta engorroso, pero se ha aplicado para detectar el virus de la rubeola en ciertos cultivos celulares.
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La hemadsorción o la interferencia distinguen a las células que posiblemente no exhiban un CPE.
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En el caso de algunos agentes, como el virus de Epstein-Barr (EBV) o el virus de inmunodeficiencia humana adquirida (HIV), pueden aplicarse enfoques aún más novedosos. Tanto el EBV como el HIV pueden replicarse in vitro en cultivos de suspensión de linfocitos humanos normales como los que se obtienen a partir de sangre del cordón umbilical de neonatos. Su presencia se determina de varias maneras; por ejemplo, los linfocitos B infectados con EBV y los linfocitos T infectados por HIV expresan antígenos específicos para el virus y DNA o RNA viral, que se puede detectar por medio de sondas inmunológicas o genómicas. Además, la transcriptasa inversa del HIV se puede detectar en un cultivo celular por medio de métodos de prueba específicos. Las sondas inmunológicas y de ácidos nucleicos (véase más adelante) también se utilizan para detectar virus en muestras clínicas o en situaciones en las que sólo se ha obtenido una replicación viral incompleta o no infecciosa in vivo o in vitro. Un ejemplo de ellas es el uso de la hibridación in situ, donde se emplean sondas específicas etiquetadas de ácidos nucleicos para detectar y localizar los genomas del papilomavirus en tejidos en los que no es posible detectar ni el virus infeccioso ni sus antígenos.
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Los antígenos del EBV y del HIV se expresan en los linfocitos.
Las sondas inmunológicas o genómicas detectan virus incompletos.
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Métodos de aislamiento in vivo
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A veces también se necesitan métodos in vivo para aislamiento, aunque sólo se llevan a cabo en laboratorios altamente especializados. El huevo de gallina embrionado aún se usa a menudo en el aislamiento inicial y la propagación de virus de la gripe A. El material que contiene el virus se inocula en la membrana adecuada del huevo y éste se incuba para permitir la replicación y reconocimiento virales. En la actualidad, la inoculación animal se utiliza sólo de manera ocasional para la detección de algunos virus. El hospedador animal habitual para el aislamiento viral es el ratón; los ratones lactantes son especialmente susceptibles a muchos virus en sus primeras 48 horas de vida. La evidencia de replicación viral se basa en el desarrollo de la enfermedad, que se manifiesta por signos como parálisis, convulsiones, disminución en la cantidad de alimentos ingeridos o muerte. La naturaleza del virus infectante se puede elucidar aún más por el análisis histológico e inmunofluorescente de los tejidos o mediante la detección de respuestas específicas de los anticuerpos. Muchos arbovirus, así como el virus de la rabia, se pueden detectar a través de este sistema.
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Se utilizan huevos embrionados y animales para el aislamiento de algunos virus.
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El aislamiento viral de un caso sospechado implica una variedad de pasos. Primero, se toman en cuenta los virus que se cree son los que más probablemente estén implicados en la enfermedad y se toman las muestras apropiadas. A menudo, en el caso de muestras de material respiratorio o fecal, se requiere de centrifugado o filtración, además de la adición de antimicrobianos, a fin de eliminar la materia orgánica, sedimentos celulares, bacterias y hongos que pudieran interferir con el aislamiento viral. A continuación, se inoculan los especímenes en los sistemas apropiados de cultivo celular. El tiempo entre la inoculación y la detección inicial de los efectos virales es variable; sin embargo, en el caso de la mayoría de los virus, los cultivos positivos suelen ser evidentes en un lapso no mayor a los cinco días después de la recolección. Por medio de los métodos apropiados de recolección y la aplicación de las herramientas diagnósticas que se discuten adelante, muchas infecciones pueden detectarse incluso a las pocas horas. En contraste, hay algunos virus que requieren cultivarse durante un mes o más antes de poder detectarse.
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Se requiere de la preparación de la muestra.
El tiempo de detección varía de días a semanas.
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Después de aislarse, por lo general, un virus puede identificarse de manera tentativa a nivel familia o género a través de sus características en el cultivo (p. ej., el tipo de CPE producido). Es posible que la confirmación e identificación adicional requieran de una potenciación del crecimiento viral a fin de producir cantidades suficientes para su análisis. Tal resultado puede lograrse mediante la inoculación del aislado original en un sistema fresco de cultivo (pase viral) a fin de amplificar la replicación del virus, así como para mejorar su adaptación al desarrollo dentro del sistema in vitro.
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La naturaleza del CPE y de los cultivos celulares afectados puede sugerir el virus.
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Neutralización y detección serológica
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De las diversas maneras para identificar al aislado, la más común es neutralizar su infectividad mediante su mezcla con un anticuerpo específico para virus conocidos antes de su inoculación en un cultivo. Así, la inhibición de los efectos virales esperados en el cultivo celular, como el CPE o la hemaglutinación, es evidencia de la presencia de ese virus. Como en el caso de la bacteriología, la demostración de antígenos virales específicos es una forma útil para la identificación de diversos agentes. La inmunofluorescencia y el inmunoensayo enzimático (EIA, enzyme immunoassay) son los métodos más comunes.
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La neutralización de los efectos biológicos mediante antisueros específicos confirma la identificación.
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Citología e histología
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En algunos casos, los virus producen cambios citológicos específicos en los tejidos del hospedador infectado, lo que auxilia al diagnóstico. Algunos ejemplos incluyen las inclusiones intranucleares específicas que se observan en infecciones neuronales ocasionadas por el herpes simple (cuerpos de Cowdry tipo A) y por las inclusiones intracitoplásmicas en la rabia (cuerpos de Negri), además de la fusión celular, que ocasiona células epiteliales multinucleares gigantes (p. ej., sarampión y varicela zóster). Aunque estos hallazgos son útiles cuando se observan, su sensibilidad y especificidad diagnóstica general suelen ser considerablemente menores que las de otros métodos discutidos.
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Las inclusiones y las células gigantes sugieren la presencia de virus.
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Microscopia electrónica
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Cuando hay viriones presentes en cantidades suficientes, pueden caracterizarse aún más a través de la aglutinación específica de las partículas virales al mezclarse con antisuero tipo específico. Esta técnica, la microscopia electrónica inmune, puede utilizarse para identificar los antígenos virales de forma específica o para detectar anticuerpos séricos mediante el uso de partículas virales de antigenicidad conocida.
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La microscopia electrónica inmune muestra la aglutinación de partículas virales.
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Algunos virus (p. ej., rotavirus humanos y virus de la hepatitis A y B) se desarrollan de manera deficiente o no lo hacen en absoluto dentro de los sistemas de cultivo de laboratorio disponibles en la actualidad. No obstante, es factible detectarlos de manera eficiente a través de métodos inmunológicos o moleculares (descritos más adelante en este capítulo).
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No todos los virus se desarrollan en los cultivos.