CAPÍTULO 4: Principios de diagnóstico por laboratorio de las enfermedades infecciosas

El diagnóstico de una infección microbiana empieza con una evaluación de las características clínicas y epidemiológicas, lo que conduce a la formulación de una hipótesis diagnóstica. Por lo general, se incluye la localización anatómica de la infección con la ayuda de los hallazgos físicos y radiológicos (p. ej., neumonía del lóbulo inferior derecho, absceso subfrénico). Este diagnóstico clínico sugiere cierto número de agentes etiológicos posibles con base en el conocimiento de los síndromes infecciosos y sus cursos. Entonces, se establece la causa específica o el diagnóstico etiológico mediante la aplicación de los métodos que se describen en el presente capítulo. Se requiere de una combinación de arte y ciencia por parte tanto del clínico como del laboratorista: el clínico debe seleccionar los exámenes y muestras biológicas adecuadas a procesarse y, en caso apropiado, sugerir los agentes etiológicos sospechados al laboratorio. El laboratorista debe utilizar los métodos que demuestren los agentes probables y estar preparado para explorar las otras posibilidades que sugieran la situación clínica o los hallazgos de las pruebas de laboratorio. Los mejores resultados se obtienen cuando la comunicación entre el clínico y el laboratorista se encuentra maximizada.

Los métodos generales para el diagnóstico de laboratorio varían con diferentes microorganismos y enfermedades infecciosas; sin embargo, los tipos de métodos por lo general son alguna combinación de exámenes microscópicos directos, cultivo, detección de antígeno y detección de anticuerpos (estudio serológico). En muchos laboratorios de microbiología clínica ahora se están usando ensayos de amplificación de ácido nucleico (NAA, nucleic acid amplification) que permiten la detección directa de componentes genómicos de patógenos. Las plataformas más nuevas de reacción en cadena de polimerasa (PCR, polymerase chain reaction) multiplexada, que permiten la detección rápida de múltiples patógenos potenciales en una reacción de prueba única son en particular promisorias. Hay paneles disponibles para patógenos respiratorios, gastrointestinales y del sistema nervioso central, directamente en especímenes apropiados, e identificación de hemocultivos positivos. Sin embargo, a pesar de ese progreso, los métodos tradicionales aún son importantes y complementarios, porque el aislamiento de microorganismos mediante cultivo se necesita para casi todas las pruebas de sensibilidad a antimicrobianos. No todos los patógenos se detectan en estos paneles, y sólo se buscan patógenos conocidos, por consiguiente, en este capítulo se consideran los principios del diagnóstico de laboratorio de enfermedades infecciosas y los métodos disponibles. Los detalles acerca de agentes particulares se comentan en los capítulos relevantes, y en la sección acerca de síndromes y causas de enfermedad infecciosa en la parte posterior del texto. Todos los métodos diagnósticos comienzan con alguna clase de espécimen recolectado a partir del paciente.

La conexión primordial entre el encuentro clínico y el laboratorio de diagnóstico es el espécimen que se entregue para su procesamiento. Si no se elige, recolecta, o ambos, de manera apropiada, no hay procedimiento de laboratorio capaz de rectificar el error. El fracaso o error al nivel de la toma de muestras es la razón más común para que resulte imposible establecer un diagnóstico etiológico o, peor aún, por lo que se sugieren diagnósticos incorrectos. En el caso de las infecciones bacterianas, el problema principal se encuentra en distinguir entre los organismos de la flora normal residente o contaminante y aquellos que están ocasionando la infección. Las tres categorías de muestras que se ilustran en la figura 4–1A–C se consideran en el texto a continuación.

Muestras directas de tejido o líquido

Las muestras biológicas directas (figura 4–1A) se recolectan a partir de tejidos (pulmón, hígado) y líquidos corporales (líquido cefalorraquídeo, sangre) normalmente estériles. Los métodos varían desde la punción-aspiración con aguja de un absceso hasta la biopsia quirúrgica. En general, este tipo de toma de muestras requiere de la participación directa de un médico y puede conllevar ciertos riesgos para el paciente. Los resultados siempre serán de utilidad ya que los hallazgos positivos son diagnósticos y los hallazgos negativos pueden excluir la infección del sitio sospechado.

Muestras indirectas

Las muestras indirectas (figura 4–1B) son especímenes de exudados inflamatorios (esputo expectorado, orina por micción) que han pasado por sitios que se sabe están colonizados con la microbiota residente. Por lo general, el sitio de origen es estéril en las personas saludables, sin embargo, es necesaria cierta evaluación de la probabilidad de contaminación con flora normal durante la recolección al momento de interpretar los resultados. Dicha evaluación requiere de un conocimiento de la flora contaminante potencial así como de los probables patógenos a buscar. Normalmente, las muestras indirectas son más convenientes tanto para el médico como para el paciente, pero conllevan un mayor riesgo de malinterpretación. En el caso de algunos especímenes, como el esputo expectorado, se han desarrollado pautas para valorar la calidad de la muestra mediante la correlación de hallazgos clínicos y microbiológicos.

Muestras de sitios con flora normal

A menudo, el sitio principal de infección se encuentra en un área que se sabe se encuentra colonizada con una diversidad de organismos (faringe e intestino grueso) (figura 4–1C); esto resulta relevante primordialmente en el caso de un diagnóstico que implique la presencia de bacterias ya que éstas dominan la composición de la microbiota. En tales instancias, se realizan análisis selectivos para detectar organismos conocidos por ocasionar infecciones y que normalmente no se encuentran en el sitio que se halla infectado. Por ejemplo, los patógenos entéricos Salmonella, Shigella y Campylobacter se pueden buscar de manera selectiva en una muestra de heces o es factible examinar un frotis faríngeo para detectar únicamente la presencia de estreptococos β-hemolíticos. En estos casos, se utilizan medios selectivos que inhiben el crecimiento de las demás bacterias, o bien, sencillamente se ignora el crecimiento de éstas. Valoraciones moleculares que establecen como objetivo los agentes patógenos específicos en estos especímenes se usan cada vez más en lugar de los cultivos selectivos.

La selección de muestras biológicas para diagnóstico viral es más fácil porque generalmente hay poca flora viral residente que desoriente la interpretación. Esto permite la selección guiada por el conocimiento de los sitios en los cuales hay más probabilidades de encontrar el agente causal sospechado; por ejemplo, los enterovirus son los virus involucrados más comúnmente en la infección aguda del sistema nervioso central.

Las muestras biológicas en las cuales podría esperarse encontrar estos agentes en cultivo o en valoraciones moleculares son exudados nasofaríngeos o de garganta, heces y líquido cefalorraquídeo.

Recolección y transporte de las muestras

El hisopo estéril es la herramienta más conveniente y más comúnmente utilizada para la recolección de muestras; sin embargo, ofrece las condiciones menos adecuadas para la supervivencia y sólo puede absorber un volumen pequeño de exudado inflamatorio y es fácilmente contaminado con la microbiota adyacente. La peor muestra biológica posible es en un hisopo reseco; la mejor es una recolección de 5 a 10 mL o más del líquido o tejido infectado. El volumen es importante porque existe la posibilidad de que en una muestra pequeña no se detecten los organismos infectantes que estén presentes en números bajos.

Las muestras deben transportarse al laboratorio tan pronto como sea posible después de su recolección, ya que algunos microorganismos sobreviven por muy poco tiempo fuera del cuerpo. Por ejemplo, a menos de que se utilicen medios de transporte especiales, las tasas de aislamiento del organismo que ocasiona la gonorrea (Neisseria gonorrhoeae) se disminuyen cuando el procesamiento se demora más allá de unos cuantos minutos. De la misma manera, muchos virus respiratorios sobreviven poco tiempo fuera del cuerpo. En contraste, algunas bacterias sobreviven de manera excelente e incluso pueden multiplicarse después de recolectada la muestra. De hecho, el crecimiento de bacilos entéricos gramnegativos en especímenes en espera de cultivarse puede comprometer la interpretación de la muestra e interferir con el aislamiento de organismos más delicados; se asocian cambios significativos con demoras mayores a las 3 o 4 horas.

Se han desarrollado diversos medios de transporte para minimizar los efectos del retraso entre la recolección de la muestra y el procesamiento del laboratorio. En general, son medios líquidos o semisólidos tamponados que contienen un mínimo de nutrientes y que están diseñados para evitar el secado, para mantener un pH neutro y para minimizar el crecimiento de contaminantes bacterianos. Quizá se requieran otras características para satisfacer requerimientos especiales, como atmósfera libre de oxígeno para anaerobios obligados, o sistemas de recolección-transporte específicos (validados) para valoraciones moleculares.

De los agentes infecciosos que se consideran en la presente obra, sólo algunos de los parásitos son del tamaño necesario para observarse a simple vista. Las bacterias y los hongos pueden observarse con claridad mediante un microscopio óptico cuando se utilizan los métodos apropiados. Los virus individuales sólo se aprecian con un microscopio electrónico, aunque los agregados de partículas virales en las células (inclusiones virales) se observan mediante microscopia óptica. Se utilizan diversas tinciones para visualizar y diferenciar microorganismos en frotis y cortes histológicos.

Microscopia óptica

El análisis directo de preparaciones teñidas o sin pigmentación por medio de la microscopia óptica (de campo brillante) (figura 4–2A) es de particular utilidad para la detección de bacterias, hongos y parásitos. Es posible visualizar aun a las bacterias más pequeñas (1–2 μm), aunque todas requieren de tinción y algunas precisan de técnicas especiales de iluminación. Dado que el límite de resolución de un microscopio óptico es de cerca de 0.2 μm, la óptica debe ser ideal si los organismos más pequeños se han de ver con claridad con un microscopio óptico.

Es posible colorear a las bacterias con una variedad de tinciones, incluyendo el azul de metileno, el cristal violeta (violeta de genciana), la fucsina carbol (rojo) y la safranina (rojo). Los dos métodos más importantes, la técnica de Gram y la acidorresistente, utilizan la tinción, la decoloración y la contratinción de tal manera que ayudan a clasificar al organismo además de colorearlo.

Tinción de Gram

El procedimiento de tinción diferencial descrito en 1884 por el médico danés Hans Christian Gram ha resultado ser uno de los más útiles en la microbiología y la medicina. El procedimiento (figura 4–3A) implica la aplicación de una solución de yodo en yoduro de potasio a células antes teñidas con un pigmento derivado de la acridina, como el cristal violeta. Este tratamiento produce una acción mordiente en la que se forman complejos morados insolubles con las proteínas ribonucleares dentro de la célula. La diferencia entre las bacterias grampositivas y gramnegativas se encuentra en la permeabilidad de la pared celular ante estos complejos al tratarse con mezclas de solventes de alcohol y acetona; esto extrae los complejos morados de la tinción de yodo de las células gramnegativas, mientras que las bacterias grampositivas las retienen. Es necesario que la pared celular se encuentre intacta para obtener una reacción positiva y existe la posibilidad de que las bacterias grampositivas no retengan el pigmento si los organismos son viejos, están muertos o si han sido dañados por agentes antimicrobianos. Rara vez un organismo gramnegativo (p. ej., Acinetobacter) parece ser grampositivo. El procedimiento se finaliza al realizar una contratinción con un pigmento rojo, como la safranina, que captan las bacterias que han sido decoloradas. Así, las bacterias teñidas de morado son grampositivas, mientras que las teñidas de rojo son gramnegativas. Como se indica en el capítulo 21, la grampositividad o gramnegatividad corresponde a diferencias estructurales importantes en la pared celular.

En muchas infecciones bacterianas, los agentes etiológicos se aprecian con facilidad en frotis de pus o líquidos con tinción de Gram. Las bacterias moradas o rojas se observan contra un fondo gramnegativo (rojo) de leucocitos, exudado y sedimento (figuras 4–3A y 4–4C). Esta información, en combinación con los hallazgos clínicos, permite guiar el manejo de la infección antes de que estén disponibles los resultados del cultivo. La interpretación de estos últimos requiere de una cantidad considerable de experiencia y conocimientos de las causas probables, de la morfología y reacción Gram y de cualquier organismo que por lo general se encuentre presente bajo condiciones de salud en el sitio de la infección.

Tinción acidorresistente

La acidorresistencia es una de las propiedades de las micobacterias (p. ej., Mycobacterium tuberculosis) y de otros organismos relacionados; por lo general, los organismos acidorresistentes se colorean de manera muy inadecuada con los pigmentos, incluyendo aquellos que se utilizan en la tinción de Gram. Sin embargo, es posible teñirlos mediante la aplicación prolongada de pigmentos más concentrados, de agentes penetrantes o mediante tratamiento con calor. Su característica singular es que, una vez teñidas, las bacterias acidorresistentes se resisten a la decoloración por medio de las concentraciones de ácidos minerales y de etanol que eliminan esos mismos pigmentos de otras bacterias. Esta combinación de tinción débil inicial y de fuerte retención una vez teñidas se relaciona con el alto contenido de lípidos de la pared celular micobacteriana. Las coloraciones acidorresistentes se finalizan con una contratinción que ofrezca un fondo contrastante para la observación de las bacterias teñidas (figura 4–3B).

En el procedimiento acidorresistente, el portaobjetos se inunda con fucsina carbol (rojo) y se decolora con ácido hidroclórico en alcohol. Cuando se realiza la contratinción con azul de metileno, los organismos acidorresistentes aparecen rojos contra un fondo azul (figura 4–4B). Una variante es la tinción con fluorocromos, que utiliza un pigmento fluorescente (auramina o una mezcla auramina-rodamina) seguida de una decoloración con ácido-alcohol. Los microorganismos acidorresistentes retienen la tinción fluorescente, lo que permite su visualización mediante microscopia de fluorescencia. La tinción de fluorocromo es más sensible y permite la detección rápida y, por ende, se ha convertido en el método elegido en casi todos los laboratorios donde se practican pruebas para microorganismos acidorresistentes.

Tinción de hongos y parásitos

Los hongos más pequeños son del tamaño de bacterias grandes y todos los organismos parasitarios son de mayor tamaño; esto permite su detección en preparaciones simples en fresco que a menudo no requieren de pigmentación. Los hongos en el esputo o en los líquidos corporales se pueden observar mediante la mezcla del espécimen con una solución de hidróxido de potasio (a fin de disolver el sedimento) y su observación con un objetivo de aumento medio. El uso de tinciones simples o fluorescentes con blanco de calcoflúor mejora la sensibilidad de la detección. Otra técnica es mezclar la muestra con tinta china, que delimita las células fúngicas (figura 4–4F). La detección de los quistes y huevos de los parásitos requiere de un procedimiento de concentración si la muestra es de heces, pero una vez realizado, se pueden visualizar con una tinción simple de yodo (figura 4–5).

Microscopia de campo oscuro y de fluorescencia

Algunas bacterias, como Treponema pallidum, que causa la sífilis, son demasiado delgadas como para observarse por medio de la iluminación habitual de campo brillante; se les aprecia por medio de la técnica de campo oscuro. Con este método, un condensador enfoca la luz de forma diagonal sobre el espécimen de tal suerte que sólo la luz que se refleja de la materia particulada como las bacterias alcanza el ocular (figura 4–2B). Los ángulos de incidencia y la luz reflejada son tales que los organismos se ven rodeados de un halo brillante contra un fondo negro. Este tipo de iluminación también se utiliza en otras técnicas microscópicas, en las que se desea un alto contraste luminoso, y para la observación de la fluorescencia. Los componentes fluorescentes, al verse excitados por la luz incidente de una longitud de onda, emiten una luz de una longitud de onda mayor y, por ende, de un color distinto. Cuando el compuesto fluorescente se conjuga con un anticuerpo como sonda de detección de un antígeno específico, la técnica se denomina inmunofluorescencia o microscopia de anticuerpos fluorescentes (figura 4–6). El aspecto es el mismo que en la microscopia de campo oscuro excepto porque el halo es el color emitido del compuesto fluorescente (figuras 4–2C y 4–6 C y D). Las tinciones de inmunofluorescencia son las más comúnmente usadas para la detección de virus, aunque cada vez más han sido reemplazadas por las valoraciones moleculares más sensibles. Para mayor seguridad, casi todos los sistemas de microscopia de fluorescencia modernos dirigen la luz incidente a través del objetivo desde arriba (epifluorescencia).

Microscopia electrónica

La microscopia electrónica muestra las estructuras mediante la transmisión de un haz de electrones y tiene entre 10 y 1000 veces el poder de resolución de los métodos de microscopia óptica. Por razones prácticas, su aplicación diagnóstica se limita a la virología donde, a causa de la resolución posible a aumentos elevados, ofrece resultados que no se pueden obtener por ningún otro método. El uso de técnicas de tinción negativa y el análisis directo de líquidos y tejidos de los sitios del cuerpo afectados permiten la visualización de partículas virales. En algunos casos, la microscopia electrónica ha sido el principal medio para descubrir virus que no crecen en los sistemas de cultivo de células habituales. Las valoraciones moleculares han remplazado gradualmente a la microscopia electrónica para la detección de muchos virus.

La propagación e identificación del agente infeccioso in vitro suele ser el medio más sensible y específico de diagnóstico y, por ende, es el método más comúnmente utilizado. En teoría, la presencia de un solo organismo vivo en la muestra puede arrojar un resultado positivo. La mayoría de las bacterias y hongos pueden cultivarse en una variedad de medios artificiales, pero a los microorganismos intracelulares estrictos (p. ej., Chlamydia, Rickettsia y virus) sólo es posible aislarlos en cultivos de células eucariotas vivas. Es posible cultivar algunos parásitos, pero esto se lleva a cabo sólo en laboratorios altamente especializados.

Aislamiento de bacterias y hongos

Casi todas las bacterias de importancia médica se pueden desarrollar fuera del hospedador en medios de cultivo artificiales. Una sola bacteria colocada en las condiciones de cultivo apropiadas se multiplicará en cantidades suficientes para que se perciban a simple vista. Los medios bacteriológicos son recetas similares a sopas preparadas a partir de digeridos de proteínas animales o vegetales suplementados con nutrientes como glucosa, extracto de levadura, suero o sangre para satisfacer los requisitos metabólicos del organismo. Su composición química es compleja y su éxito depende de que cumplan con los requisitos nutricionales de la mayoría de los seres vivos heterótrofos. Los mismos enfoques y algunos de los mismos medios de cultivo que se utilizan para las bacterias también se usan en el caso de los hongos.

La propagación en medios preparados en estado líquido (caldos) es evidente cuando el número de bacterias es suficiente para producir turbidez o aglutinaciones macroscópicas. La turbidez es el resultado de la cantidad de luz que se refleja de las bacterias; dependiendo del tamaño del organismo, se requiere de más de 106 bacterias por mililitro de caldo. La adición de un agente gelificante a un caldo de cultivo permite su preparación en sólido en forma de placas en cajas de Petri. El agente gelificante universal para la bacteriología diagnóstica es el agar-agar, un polisacárido que se extrae de algas marinas. El agar-agar es conveniente en cuanto a que se licua a cerca de 95 °C, pero no retorna a un estado de gel sólido hasta que se enfría a menos de 50 °C, lo que permite añadir al cultivo sustancias lábiles al calor, como sangre, antes de que gelifique. A las temperaturas que se utilizan en el laboratorio diagnóstico (37 °C o menos) el agar-agar existe como un gel nutritivo liso y sólido. Este medio, normalmente denominado “agar”, puede calificarse con la descripción de cualquier suplemento que contenga (p. ej., agar sangre).

Una útil característica de las placas de agar es que las bacterias pueden separarse al extender una pequeña muestra del producto biológico sobre su superficie. Las células bacterianas bien separadas de las demás crecen en colonias aisladas que a menudo alcanzan los 2 a 3 mm de diámetro después de incubarse durante la noche, lo que permite aislar las bacterias en un cultivo puro porque se asume que la colonia ha surgido a partir de un solo organismo (figura 4–7). Las colonias varían enormemente en cuanto a su tamaño, forma, textura, color y otras características denominadas morfología de la colonia. Las colonias de diferentes especies o géneros a menudo difieren en forma sustancial, mientras que aquellas derivadas de la misma cepa suelen ser consistentes. Las diferencias en la morfología de la colonia son de gran utilidad para separar a las bacterias dentro de una mezcla y para obtener pistas en cuanto a su identidad. En la figura 4–8 se muestran algunos ejemplos de morfología de la colonia.

También se utilizan nuevos métodos que no dependen de los cambios visuales en el medio de cultivo o en la formación de colonias para detectar la propagación bacteriana en un cultivo; estas técnicas incluyen los cambios ópticos, químicos y eléctricos que se producen en el medio a causa del número creciente de células bacterianas o de sus productos metabólicos. Muchos de estos métodos son más sensibles que las técnicas clásicas y, por ende, detectan la propagación horas o, incluso, días antes que los métodos tradicionales. Algunos también se han rediseñado en cuanto a instrumentación y automatización; por ejemplo, un sistema totalmente automatizado que detecta el metabolismo bacteriano por fluorometría permite llevar a cabo una identificación bacteriana y una prueba de susceptibilidad antimicrobiana en 2 a 4 horas.

Medios de cultivo

A lo largo de los últimos 100 años, los microbiólogos han desarrollado incontables medios auxiliares para el aislamiento e identificación de bacterias y hongos de importancia médica. Sólo unos cuantos han llegado a utilizarse en forma rutinaria en los laboratorios clínicos y es factible clasificarlos como medios nutritivos, selectivos o indicadores.

Medios nutritivos

El componente nutritivo de un medio está diseñado para satisfacer los requisitos de crecimiento del organismo a fin de permitir su aislamiento y propagación; para propósitos médicos, el medio ideal permitiría el crecimiento rápido de todos los agentes. No existe tal medio; sin embargo, existen varios que son suficientes para la propagación adecuada de la mayoría de las bacterias y hongos de importancia médica. Estos medios se preparan con los productos digeridos enzimáticos o ácidos de productos animales o vegetales como músculos, leche o soya. El digerido reduce la proteína original a una mezcla de polipéptidos y aminoácidos que también incluye metales traza, coenzimas y diversos factores de crecimiento indefinidos; por ejemplo, un caldo común contiene un digerido pancreático de caseína (proteína láctea) y un digerido papaico de harina de soya. Una opción es añadir sales, vitaminas o líquidos corporales como suero a esta base nutritiva, a fin de proporcionar a los patógenos las condiciones necesarias para su desarrollo óptimo.

Medios selectivos

Los medios selectivos se usan cuando microorganismos patógenos específicos se buscan en sitios con una microbiota extensa (p. ej., especies de Campylobacter en especímenes de heces). En estos casos, las demás bacterias pueden desarrollarse más que la especie etiológica sospechada en un medio nutritivo sencillo, ya sea porque el patógeno crece más lentamente o porque se presenta en cantidades mucho más pequeñas. Por lo general, los medios selectivos contienen pigmentos, otros aditivos químicos o agentes antimicrobianos en concentraciones diseñadas para inhibir la flora contaminante pero no el patógeno sospechado.

Medios indicadores

Los medios indicadores contienen sustancias diseñadas para mostrar las características bioquímicas o únicas de otro tipo de patógenos o grupos de organismos. A menudo se utiliza la adición de uno o más carbohidratos y un indicador de pH al medio. Un cambio de color en la colonia indica la presencia de productos ácidos y, por ende, de fermentación u oxidación del hidrato de carbono por parte del organismo. Añadir eritrocitos a las placas permite que se utilice la hemólisis que producen algunos organismos como característica de diferenciación. En la práctica, es frecuente que se combinen las propiedades nutritivas, selectivas e indicadoras a diversos grados dentro de un mismo medio. Es posible incluir un sistema indicador dentro de un medio altamente nutritivo y también hacerlo selectivo al añadir los antimicrobianos adecuados. Algunos ejemplos de los medios de cultivo que por lo común se utilizan en la microbiología diagnóstica se listan en el apéndice 4–1 y se ofrecen más detalles de su composición y aplicación en el apéndice 4–2.

Condiciones atmosféricas

Aeróbicas

Una vez inoculados, los cultivos de la mayoría de las bacterias anaerobias se colocan en una incubadora con una temperatura constante entre 35 y 37 °C. En ocasiones, se utilizan temperaturas ligeramente mayores o menores para favorecer un cierto organismo o grupo de organismos en forma selectiva. La mayoría de las bacterias que no son anaerobias obligadas crecen en el aire; sin embargo, algunas requieren de CO₂ y el mismo compuesto potencia el crecimiento de otras. Las incubadoras que mantienen una concentración de 2 a 5% de CO₂ en el aire se utilizan con frecuencia para el aislamiento primario porque este nivel no es dañino para ningún tipo de bacteria y mejora el aislamiento de algunas. Un método más sencillo es el del frasco con vela, en el cual se permite que una vela permanezca encendida hasta que se consuma en un frasco sellado que contenga placas; este método añade 1 a 2% de CO₂ a la atmósfera. Algunas bacterias (p. ej., Campylobacter) requieren una atmósfera microaerofílica con concentración reducida de oxígeno (5%) y aumentada de CO₂ (10%) para crecer. Lo anterior se puede alcanzar al usar un paquete disponible en el comercio que se coloca en un frasco que a continuación se sella de manera similar al sistema anaeróbico descrito más adelante.

Anaeróbicas

Las bacterias estrictamente anaerobias no crecen bajo las condiciones antes descritas y muchas mueren al verse expuestas al oxígeno atmosférico o a altos potenciales de oxidorreducción. La mayoría de los anaerobios de importancia médica crecen en las profundidades de medios líquidos o semisólidos que contienen cualquier variedad de agentes reductores, como cisteína, tioglucolato, ácido ascórbico o, incluso, limaduras de hierro. Es posible lograr un ambiente anaeróbico para la incubación de las placas al reemplazar el aire con una mezcla de gases que contenga hidrógeno, CO₂ y nitrógeno, y permitiendo que el hidrógeno reaccione con el oxígeno residual en un catalizador para que forme agua. Un sistema comercial conveniente logra esto en forma química en un paquete al que se le añade agua antes de sellar el frasco. Las muestras que se sospeche contienen números significativos de anaerobios deben procesarse bajo condiciones diseñadas para minimizar la exposición al oxígeno atmosférico en toda etapa.

Sistemas de microbiología clínica

Se requieren sistemas de rutina en el laboratorio para procesar muestras provenientes de diversos sitios porque no existe un solo medio o atmósfera que sea ideal para todas las bacterias. Las combinaciones de caldos y placas sólidas, así como de incubación aeróbica, en CO₂ y anaeróbica, deben ajustarse según los organismos esperados para cualquier localización o circunstancia clínica particular. El cuadro 4–1 muestra ejemplos de este tipo de rutinas. En general, no resulta práctico incluir medios especializados para el aislamiento de organismos inusuales como Corynebacterium diphtheriae o Legionella pneumophila; para la detección de esos y otros organismos poco comunes es necesario que el médico informe al laboratorio puntualmente en cuanto a la posibilidad de su presencia. Entonces, se pueden incluir medios y procedimientos especiales.

Identificación

Cuando se detecta crecimiento en cualquier medio, comienza el proceso de identificación, lo que comprende métodos para obtener cultivos puros a partir de colonias únicas, seguidos por pruebas diseñadas para caracterizar el aislado e identificarlo. Las pruebas exactas y sus secuencias varían con diferentes grupos de microorganismos, y el nivel taxonómico (género, especie, subespecie, etcétera) de identificación necesario varía de acuerdo con la utilidad médica de la información. En algunos casos, sólo es importante una descripción general o la exclusión de microorganismos particulares; por ejemplo, un informe de “flora oral mixta” en un espécimen de esputo o “no se aisló Salmonella, Shigella ni Campylobacter” en un espécimen de heces en ocasiones proporciona toda la información necesaria. La espectrometría de masas MALDI-TOF (desorción-ionización láser asistida por matriz-tiempo de vuelo, matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight) se ha convertido en una importante herramienta nueva usada para la identificación rápida de microorganismos ya aislados en cultivo puro; complementa los métodos tradicionales, pero no anula por completo la necesidad de esos métodos.

Características que se utilizan para la clasificación de bacterias y hongos

Características culturales

Las características culturales incluyen la demostración de propiedades, como los requisitos nutricionales únicos, producción de pigmento y capacidad de crecer en presencia de ciertas sustancias (cloruro de sodio, bilis) o en ciertos medios (agar MacConkey, nutritivo). También se utiliza un análisis de la capacidad de desarrollo a ciertas temperaturas o de ocasionar hemólisis en placas de agar sangre. En el caso de los hongos, la proliferación como colonia de levaduras o moho es el separador primario; en el caso de los mohos, la morfología de las estructuras del moho (hifas, conidios, etc.) es el medio principal de identificación.

Características bioquímicas

La capacidad de atacar diversos sustratos o de fabricar productos metabólicos particulares tiene una amplia aplicación para la identificación de bacterias y levaduras. Las propiedades más comunes que se analizan se comentan en el apéndice 4–3. Las pruebas bioquímicas y de cultivo para la identificación bacteriana se analizan por referencia a cuadros que muestran los patrones de reacción característicos de especies individuales; de hecho, los avances en el análisis computarizado se han aplicado en la actualidad a la identificación de muchos grupos bacterianos y fúngicos. Estos sistemas utilizan los mismos principios bioquímicos junto con bases de datos computarizadas a fin de determinar la identificación más probable a partir de los patrones de prueba observados.

Producción de toxina y patogenicidad

Rara vez se necesita evidencia directa de virulencia en animales de laboratorio para confirmar un diagnóstico clínico. En algunas enfermedades causadas por la producción de una toxina específica, la toxina se puede detectar in vitro por medio de cultivos de células o métodos inmunológicos. La neutralización del efecto tóxico con antitoxina específica es el método habitual para identificar la toxina. Las pruebas para toxina sólo se efectúan en laboratorios especializados; se han desarrollado valoraciones moleculares para algunas toxinas.

Estructura antigénica

Los virus, las bacterias, los hongos y los parásitos poseen muchos antígenos, como polisacáridos capsulares, proteínas de superficie y componentes de la pared celular. El estudio serológico comprende el uso de anticuerpos de especificidad conocida para detectar antígenos presentes en organismos enteros o libres en extractos (antígenos solubles). Los métodos usados para demostrar reacciones de antígeno-anticuerpo se comentan en “Detección de anticuerpos (estudio serológico)”.

Estructura genómica

La relación de secuencia de ácido nucleico según se determina mediante comparaciones de homología y de secuencia directa se ha convertido en un determinante primario de las decisiones taxonómicas. Se comentan más adelante en la sección sobre métodos con ácido nucleico.

Aislamiento e identificación de virus

Cultivos de células y órganos

Los cultivos de células vivas capaces de sustentar su replicación son los medios principales para el aislamiento de virus patogénicos. Las células se derivan de una fuente de tejidos mediante la proliferación celular a partir de un fragmento de tejido (explante) o por la dispersión de agentes proteolíticos como la tripsina. Se les permite crecer en un medio nutritivo sobre una superficie de vidrio o plástico hasta que se obtiene una capa confluente de una célula de espesor (monocapa). En algunas circunstancias se realiza un cultivo in vitro de un fragmento de tejido con una función especializada (p. ej., tráquea fetal con células epiteliales ciliadas) que se utiliza para la detección viral; este procedimiento se conoce como cultivo de órganos.

En la virología diagnóstica se utilizan tres tipos básicos de monocapas de cultivos celulares. El cultivo celular primario, en el que todas las células tienen un conteo cromosómico normal (diploide), se deriva del crecimiento inicial de células de una fuente de tejido. Una segunda dispersión y propagación producen el cultivo celular secundario, que por lo normal retiene características similares a aquellas del cultivo primario (cuenta cromosómica diploide y susceptibilidad a virus). Las células renales embrionarias de monos y humanos son ejemplos de cultivos celulares primarios y secundarios de uso común.

Las dispersiones y cultivos posteriores de los cultivos celulares secundarios por lo general conducen a uno de dos resultados: las células mueren con el tiempo o pasan por una transformación espontánea en la que cambian las características del desarrollo, varía la cuenta cromosómica (haploide o heteroploide) y difiere la susceptibilidad a la infección vírica en contraste con el cultivo original. Estos cultivos celulares tienen características de “inmortalidad”; es decir, pueden volver a dispersarse y cultivarse en diversas ocasiones (pases seriados de cultivos celulares). También pueden obtenerse a partir de células de tejido canceroso o producirse mediante exposición a agentes mutagénicos in vitro. Tales cultivos se conocen comúnmente como líneas celulares. Una línea celular de uso diagnóstico común es la Hep-2, derivada de un carcinoma epitelial humano. Un tercer tipo de cultivo a menudo se denomina cepa celular; este cultivo consiste en células diploides, a menudo fibroblásticas, que pueden volver a dispersarse y cultivarse un número finito de veces, por lo general pueden hacerse 30 a 40 pases del cultivo celular antes de que la cepa se agote o presente transformaciones espontáneas. La amígdala y los fibroblastos pulmonares embrionarios de humano son cepas de células comunes usadas en laboratorios de virología clínica donde aún se efectúan cultivos. Las valoraciones moleculares que son más rápidas, más sensibles y más rentables, han reemplazado a las técnicas de cultivo viral estándar en muchos laboratorios.

Se han desarrollado técnicas de detección de antígenos en cultivo (shell vial) con el uso de cubreobjetos con monocapas de líneas de células para algunos virus (p. ej., citomegalovirus, virus respiratorios), a fin de proporcionar un método de cultivo más rápido. El virus se amplifica en los viales para cultivo de células después de centrifugación a baja velocidad. A continuación se usan técnicas de tinción fluorescentes con el uso de anticuerpos monoclonales para el virus específico, a fin de detectar antígenos virales tempranos antes de la aparición del efecto citopático (CPE, cytopathic effect).

Las células provenientes de tejido canceroso pueden crecer de manera continua

Detección del desarrollo viral

El desarrollo viral en cultivos celulares susceptibles se detecta de diversas maneras. El efecto más común se observa en el caso de virus líticos o citopáticos; a medida que se replican dentro de las células, producen alteraciones en la morfología celular (o muerte celular), que se puede observar en forma directa por microscopia óptica a aumentos bajos (30× o 100×). Dicho efecto citopático (CPE) varía con diferentes virus en cultivos celulares distintos; por ejemplo, es frecuente que los enterovirus produzcan células redondeadas, pleomorfismo y posterior muerte celular en diversos sistemas de cultivo, mientras que el sarampión y los virus respiratorios sincitiales ocasionan la fusión celular para producir células gigantes multinucleares (sincitios). La apariencia microscópica de algunos cultivos celulares normales y el CPE que distintos virus producen en los mismos se ilustran en la figura 4–9.

Otros virus se pueden detectar en un cultivo celular a causa de su capacidad para producir hemaglutininas; es posible que estas hemaglutininas se encuentren en las membranas de las células infectadas, así como en el medio de cultivo, como resultado de la liberación de viriones hemaglutinantes provenientes de estas células. La adición de hematíes al cultivo celular infectado ocasiona su adherencia a las superficies celulares, fenómeno conocido como hemadsorción. Otro método de detección viral en cultivos celulares es la interferencia. En esta situación, el virus que infecta al cultivo celular susceptible no produce un CPE ni hemaglutinina, pero se puede detectar al “desafiar” al cultivo celular con un virus distinto que normalmente produce un CPE característico. El segundo virus, o virus de desafío, no infecta al cultivo celular a causa de la interferencia producida por el primer virus, que entonces se detecta. Es evidente que este método resulta engorroso, pero se ha aplicado para detectar el virus de la rubeola en ciertos cultivos celulares.

En el caso de algunos agentes, como el virus de Epstein-Barr (EBV) o el virus de inmunodeficiencia humana adquirida (HIV), pueden aplicarse enfoques aún más novedosos. Tanto el EBV como el HIV pueden replicarse in vitro en cultivos de suspensión de linfocitos humanos normales como los que se obtienen a partir de sangre del cordón umbilical de neonatos. Su presencia se determina de varias maneras; por ejemplo, los linfocitos B infectados con EBV y los linfocitos T infectados por HIV expresan antígenos específicos para el virus y DNA o RNA viral, que se puede detectar por medio de sondas inmunológicas o genómicas. Además, la transcriptasa inversa del HIV se puede detectar en un cultivo celular por medio de métodos de prueba específicos. Las sondas inmunológicas y de ácidos nucleicos (véase más adelante) también se utilizan para detectar virus en muestras clínicas o en situaciones en las que sólo se ha obtenido una replicación viral incompleta o no infecciosa in vivo o in vitro. Un ejemplo de ellas es el uso de la hibridación in situ, donde se emplean sondas específicas etiquetadas de ácidos nucleicos para detectar y localizar los genomas del papilomavirus en tejidos en los que no es posible detectar ni el virus infeccioso ni sus antígenos.

Métodos de aislamiento in vivo

A veces también se necesitan métodos in vivo para aislamiento, aunque sólo se llevan a cabo en laboratorios altamente especializados. El huevo de gallina embrionado aún se usa a menudo en el aislamiento inicial y la propagación de virus de la gripe A. El material que contiene el virus se inocula en la membrana adecuada del huevo y éste se incuba para permitir la replicación y reconocimiento virales. En la actualidad, la inoculación animal se utiliza sólo de manera ocasional para la detección de algunos virus. El hospedador animal habitual para el aislamiento viral es el ratón; los ratones lactantes son especialmente susceptibles a muchos virus en sus primeras 48 horas de vida. La evidencia de replicación viral se basa en el desarrollo de la enfermedad, que se manifiesta por signos como parálisis, convulsiones, disminución en la cantidad de alimentos ingeridos o muerte. La naturaleza del virus infectante se puede elucidar aún más por el análisis histológico e inmunofluorescente de los tejidos o mediante la detección de respuestas específicas de los anticuerpos. Muchos arbovirus, así como el virus de la rabia, se pueden detectar a través de este sistema.

El aislamiento viral de un caso sospechado implica una variedad de pasos. Primero, se toman en cuenta los virus que se cree son los que más probablemente estén implicados en la enfermedad y se toman las muestras apropiadas. A menudo, en el caso de muestras de material respiratorio o fecal, se requiere de centrifugado o filtración, además de la adición de antimicrobianos, a fin de eliminar la materia orgánica, sedimentos celulares, bacterias y hongos que pudieran interferir con el aislamiento viral. A continuación, se inoculan los especímenes en los sistemas apropiados de cultivo celular. El tiempo entre la inoculación y la detección inicial de los efectos virales es variable; sin embargo, en el caso de la mayoría de los virus, los cultivos positivos suelen ser evidentes en un lapso no mayor a los cinco días después de la recolección. Por medio de los métodos apropiados de recolección y la aplicación de las herramientas diagnósticas que se discuten adelante, muchas infecciones pueden detectarse incluso a las pocas horas. En contraste, hay algunos virus que requieren cultivarse durante un mes o más antes de poder detectarse.

Identificación viral

Después de aislarse, por lo general, un virus puede identificarse de manera tentativa a nivel familia o género a través de sus características en el cultivo (p. ej., el tipo de CPE producido). Es posible que la confirmación e identificación adicional requieran de una potenciación del crecimiento viral a fin de producir cantidades suficientes para su análisis. Tal resultado puede lograrse mediante la inoculación del aislado original en un sistema fresco de cultivo (pase viral) a fin de amplificar la replicación del virus, así como para mejorar su adaptación al desarrollo dentro del sistema in vitro.

Neutralización y detección serológica

De las diversas maneras para identificar al aislado, la más común es neutralizar su infectividad mediante su mezcla con un anticuerpo específico para virus conocidos antes de su inoculación en un cultivo. Así, la inhibición de los efectos virales esperados en el cultivo celular, como el CPE o la hemaglutinación, es evidencia de la presencia de ese virus. Como en el caso de la bacteriología, la demostración de antígenos virales específicos es una forma útil para la identificación de diversos agentes. La inmunofluorescencia y el inmunoensayo enzimático (EIA, enzyme immunoassay) son los métodos más comunes.

Citología e histología

En algunos casos, los virus producen cambios citológicos específicos en los tejidos del hospedador infectado, lo que auxilia al diagnóstico. Algunos ejemplos incluyen las inclusiones intranucleares específicas que se observan en infecciones neuronales ocasionadas por el herpes simple (cuerpos de Cowdry tipo A) y por las inclusiones intracitoplásmicas en la rabia (cuerpos de Negri), además de la fusión celular, que ocasiona células epiteliales multinucleares gigantes (p. ej., sarampión y varicela zóster). Aunque estos hallazgos son útiles cuando se observan, su sensibilidad y especificidad diagnóstica general suelen ser considerablemente menores que las de otros métodos discutidos.

Microscopia electrónica

Cuando hay viriones presentes en cantidades suficientes, pueden caracterizarse aún más a través de la aglutinación específica de las partículas virales al mezclarse con antisuero tipo específico. Esta técnica, la microscopia electrónica inmune, puede utilizarse para identificar los antígenos virales de forma específica o para detectar anticuerpos séricos mediante el uso de partículas virales de antigenicidad conocida.

Algunos virus (p. ej., rotavirus humanos y virus de la hepatitis A y B) se desarrollan de manera deficiente o no lo hacen en absoluto dentro de los sistemas de cultivo de laboratorio disponibles en la actualidad. No obstante, es factible detectarlos de manera eficiente a través de métodos inmunológicos o moleculares (descritos más adelante en este capítulo).

La microbiología diagnóstica hace mucho uso de la especificidad de los enlaces entre antígenos y anticuerpos. Se utilizan antisueros de especificidad conocida para detectar su antígeno homólogo en los cultivos o, de manera más reciente, directamente en los líquidos corporales. Por otra parte, las preparaciones de antígenos conocidos se utilizan para detectar anticuerpos circulantes como evidencia de una infección actual o anterior con ese agente. Se utiliza una variedad de métodos para demostrar la unión antígeno-anticuerpo. La especificidad enormemente mejorada de los anticuerpos monoclonales ha tenido un gran impacto sobre la calidad de los métodos en los casos en que se han aplicado. Antes de discutir su aplicación diagnóstica, se consideran los principios implicados en los métodos de mayor importancia.

Métodos para la detección de la reacción antígeno-anticuerpo

Precipitación

Cuando antígenos y anticuerpos se combinan en proporciones adecuadas, se forma un precipitado visible. Se pueden producir proporciones óptimas antígeno-anticuerpo permitiendo que uno se difunda en el otro, principalmente a través de una matriz de agar (inmunodifusión). En el procedimiento de inmunodifusión se cortan pozos en el agar y se llenan con antígenos y anticuerpos. Es posible que se formen una o más líneas de precipitina entre los pozos de antígenos y anticuerpos, dependiendo del número de reacciones diferentes antígeno-anticuerpo que se presenten. La contrainmunoelectroforesis (CIE) es una técnica de inmunodifusión que se lleva a cabo en un campo electroforético. El efecto neto es que los antígenos y los anticuerpos se reúnen de manera rápida en el espacio entre los pozos para formar la línea de precipitina.

La cantidad de antígenos o anticuerpos necesarios para producir una reacción inmunológica visible se puede reducir si cualquiera de ambos se encuentra en la superficie de una partícula relativamente grande. Esta condición puede producirse mediante la fijación de antígenos o anticuerpos solubles a la superficie de eritrocitos o de partículas microscópicas de látex suspendidas en un tubo de ensayo o en un pozo de placa de microtitulación (figura 4–10). Las bacterias completas son lo bastante grandes como para funcionar como partícula si el antígeno se encuentra presente en la superficie microbiana. Así, las proporciones relativas de antígeno y anticuerpo se vuelven menos críticas y las reacciones antígeno-anticuerpo pueden detectarse por aglutinación cuando el suero inmune y las partículas antigénicas, o el anticuerpo asociado a las partículas y el antígeno soluble, se mezclan en un portaobjetos. El proceso se denomina aglutinación en portaobjetos, hemaglutinación o aglutinación de látex, dependiendo de la naturaleza de la partícula sensibilizada.

Neutralización

La neutralización toma alguna función observable del agente, como el efecto citopático de los virus o la acción de una toxina bacteriana, y la neutraliza. Por lo general, esto se lleva a cabo haciendo que, en primera instancia, el agente reaccione con el anticuerpo y, después, colocando la mezcla antígeno-anticuerpo en el sistema de prueba. Los pasos involucrados se ilustran en la figura 4–11. En el caso de la neutralización viral, una sola molécula de anticuerpo puede unirse a los componentes superficiales del virus extracelular e interferir con alguno de los eventos iniciales del ciclo de la multiplicación viral (adsorción, penetración o desnudamiento). Algunos agentes bacterianos y virales se enlazan directamente a los hematíes (hemaglutinación). La neutralización de esta reacción mediante el bloqueo del receptor por parte del anticuerpo se denomina inhibición de la hemaglutinación (figura 4–12).

Fijación del complemento

Las pruebas de fijación del complemento dependen de dos propiedades del complemento. La primera es la fijación (inactivación) del complemento ante la formación de los complejos antígeno-anticuerpo. La segunda es la capacidad que tiene el complemento fijado para ocasionar la hemólisis en ovejas (hematíes cubiertos con anticuerpo de eritrocitos antioveja [hematíes sensibilizados]). Las pruebas de fijación del complemento se llevan a cabo en dos etapas: el sistema de prueba reacciona con el antígeno y el anticuerpo en presencia del complemento; el sistema indicador, que contiene los hematíes sensibilizados, detecta el complemento residual. La hemólisis indica que el complemento se encontraba presente en el sistema indicador y que, por ende, no se formaron complejos antígeno-anticuerpo dentro del sistema de prueba. Utilizada primordialmente para la detección y cuantificación de anticuerpos, la fijación del complemento se ha visto reemplazada, en la mayoría de los casos, por métodos más sencillos que pueden automatizarse.

Métodos de marcaje

La detección de la unión antígeno-anticuerpo se puede potenciar mediante la adhesión de una etiqueta o marcador a uno de ellos (normalmente, el anticuerpo) y al detectar el marcador después de la eliminación de reactivos no ligados. La etiqueta puede ser un pigmento fluorescente (inmunofluorescencia), un radioisótopo (radioinmunoensayo o RIA) o una enzima (inmunoensayo enzimático o EIA). La presencia o cuantificación de la unión antígeno-anticuerpo se mide mediante la fluorescencia, la radiactividad o por la reacción química que cataliza la enzima.

Inmunofluorescencia

El método de marcaje más común en la microbiología diagnóstica es la inmunofluorescencia (figura 4–6), en la que el anticuerpo se marca con un tinte fluorescente, por lo general isotiocianato de fluoresceína (FITC, fluorescein isothiocyanate); se aplica a un portaobjetos de material que puede contener el antígeno buscado. Mediante la microscopia de fluorescencia, el marcaje del anticuerpo etiquetado se puede detectar como un halo color verde brillante que rodea a la bacteria o, en el caso de virus, como un cúmulo fluorescente sobre o dentro de una célula infectada. Dicho método se denomina “directo” si el FITC se conjuga directamente al anticuerpo con la especificidad deseada. En el caso de la inmunofluorescencia “indirecta”, no se etiqueta el anticuerpo específico, sino que su unión con el antígeno se detecta en un paso adicional donde se utiliza un anticuerpo antiinmunoglobulina etiquetado con FITC que se une con el anticuerpo específico. La elección entre ambas técnicas depende puramente de consideraciones técnicas.

Radioinmunoensayo (RIA, radioimmunoassay) e inmunoensayo enzimático (EIA, enzyme immunoassay)

Las etiquetas que se utilizan en el RIA y el EIA son más adecuadas para las pruebas de fase líquida y se utilizan principalmente en virología. También se utilizan en los métodos directos e indirectos y en muchas otras variaciones ingeniosas como los métodos de “sándwich”, así llamados porque el antígeno de interés queda “atrapado” entre dos anticuerpos (figura 4–13). Dichas técnicas en extremo sensibles se consideran con mayor detalle en cuanto a detección de anticuerpos.

Clasificación serológica

Para los antígenos de importancia diagnóstica más notables existen antisueros comercialmente disponibles. Los métodos de prueba más comunes en el caso de las bacterias son la aglutinación y la inmunofluorescencia y, en el caso de los virus, la neutralización. En la mayoría de los casos, estos métodos subclasifican a los organismos por debajo del nivel de especie y, por ende, son de valor principalmente para usos epidemiológicos y de investigación. Los términos “serotipo” y “serogrupo” se utilizan junto con números, letras o números romanos sin otra lógica aparente que el precedente histórico. En unos cuantos géneros, la diferenciación taxonómica más fundamental es serológica; tal es el caso para los estreptococos, en cuyo caso se reemplazó la clasificación existente basada en características bioquímicas y culturales debido a que el esquema de clasificación serológico desarrollado por Rebecca Lancefield se correlaciona mejor con la enfermedad.

Antes de que sea posible aplicar estas técnicas al diagnóstico de enfermedades infecciosas específicas, se requiere del estudio exhaustivo del (los) agente(s) causante(s). Los sistemas antígeno-anticuerpo pueden variar en complejidad de un solo epítope a múltiples epítopes en diversos antígenos macromoleculares, cuya naturaleza química puede o no ser conocida. La causa del brote original de legionelosis de 1976 (provocado por Legionella pneumophila) se comprobó a través del desarrollo de reactivos inmunitarios que detectaron las bacterias en el tejido y los anticuerpos dirigidos en contra de las bacterias en el suero de los pacientes. Ahora, más de 40 años después, existe más de una docena de serotipos y muchas especies adicionales, cada una de las cuales requiere de reactivos inmunológicos específicos para la detección del antígeno o de los anticuerpos a fin de llevar a cabo un diagnóstico.

Detección de anticuerpos

Durante una infección —viral, bacteriana, fúngica o parasitaria— el hospedador normalmente responde con la formación de anticuerpos, que pueden detectarse mediante la modificación de cualquiera de los métodos utilizados para la detección de antígenos. La formación de anticuerpos y su curso temporal dependen de la estimulación antigénica proporcionada por la infección. Estos patrones precisos varían dependiendo de los antígenos utilizados, de las clases de anticuerpos detectados y del método. Un ejemplo de los patrones temporales de desarrollo, aumento y disminución de los anticuerpos antivirales específicos que se miden a través de distintas pruebas se ilustra en la figura 4–14; tales respuestas pueden utilizarse para detectar evidencia de infecciones recientes o pasadas. Los métodos de prueba no indican la clase de inmunoglobulina, pero es posible modificarlos para que lo hagan, normalmente mediante tratamiento previo del suero para eliminar la IgG a fin de diferenciar entre las respuestas IgM e IgG. Deben enfatizarse varios principios básicos.

1. En una infección aguda, los anticuerpos suelen aparecer temprano en el curso de la enfermedad, para después aumentar de manera repentina a lo largo de los siguientes 10 a 21 días. Así, una muestra de suero recolectada poco después del inicio de la enfermedad (suero agudo) y otra recolectada 2 a 3 semanas después (suero convaleciente) pueden compararse cuantitativamente en cuanto a los cambios en el contenido específico de anticuerpos.

2. Los anticuerpos se cuantifican por diversos medios. El método más común es diluir el suero en forma seriada en un medio adecuado y determinar la dilución máxima que aún arrojará anticuerpos detectables en el sistema de prueba (p. ej., diluciones séricas de 1:4, 1:8 y 1:16). La dilución máxima que retiene actividad específica se denomina “título de anticuerpos”.

3. La interpretación de respuestas significativas de anticuerpos (evidencia de infección específica reciente) tiene confiabilidad máxima cuando se demuestra evidencia definitiva de seroconversión; es decir, el anticuerpo específico detectable no se encuentra en el suero agudo, pero sí en el suero convaleciente. De manera alternativa, un aumento de cuatro veces o más en el título de anticuerpos da sustentación al diagnóstico de infección reciente; por ejemplo, un título de suero agudo de 1:4 o menos y un título de suero convaleciente de 1:16 o mayor se consideraría significativo.

4. En los casos en que se conozcan los títulos promedio de anticuerpos de una población ante un agente específico, un título de anticuerpos de suero convaleciente significativamente mayor a la media esperada puede utilizarse como sustentación o evidencia probable de infección reciente. Sin embargo, este hallazgo es considerablemente menos valioso que aquellos obtenidos mediante la comparación de las respuestas de muestras de suero agudas y convalecientes. Un método alternativo y algo más complejo de serodiagnóstico es determinar qué subclase principal de inmunoglobulina constituye la proporción primordial de anticuerpos específicos. En las infecciones primarias, la respuesta IgM específica a menudo domina durante los primeros días o semanas después del inicio, pero se ve reemplazada progresivamente por anticuerpos IgG específicos: así, de 1 a 6 meses después de la infección, los anticuerpos predominantes pertenecen a la subclase IgG. En consecuencia, un suero que contuviera un título elevado de anticuerpos de la subclase IgM sugeriría una infección primaria reciente.

Los métodos inmunológicos que se utilizan para la identificación de antígenos bacterianos o virales se aplican al diagnóstico serológico mediante la simple inversión del sistema de detección: es decir, mediante el uso de un antígeno conocido para detectar la presencia de un anticuerpo. Los métodos de diagnóstico serológico a utilizarse se seleccionan con base en su conveniencia y aplicabilidad al antígeno en cuestión. Como se muestra en la figura 4–14, las relaciones temporales de la respuesta de anticuerpos a la infección varían según el método utilizado. De los métodos para medir la interacción antígeno-anticuerpo que se discutieron antes, los que se utilizan con mayor frecuencia en la actualidad para el diagnóstico serológico son la aglutinación, RIA y EIA.

Western blot (electrotransferencia Western)

La inmunovaloración con electrotransferencia Western es otra técnica que ahora se usa comúnmente para detectar la especificidad de anticuerpos contra diversos epítopos, y para confirmarla. Su mayor uso ha sido en el diagnóstico de infecciones por HIV (capítulo 18), en el cual se efectúa electroforesis de viriones en un gel de poliacrilamida a fin de separar los componentes de proteína y glucoproteína, y después se transfieren sobre nitrocelulosa. Esto a continuación se incuba con suero del paciente, y el anticuerpo contra los diferentes componentes virales se detecta al usar un anticuerpo globulina IgG antihumano conjugado con una marca enzimática. Las valoraciones de EIA más nuevas que detectan el antígeno P24, así como anticuerpos contra el HIV, obvian la necesidad de la valoración de electrotransferencia Western en los laboratorios en los que se usan estas valoraciones (figura 4–15).

Detección de antígenos

En teoría, cualquiera de los métodos descritos para la detección de las interacciones antígeno-anticuerpo se puede aplicar de manera directa a las muestras clínicas. El más común de ellos es la inmunofluorescencia, en la que se detecta el antígeno sobre la superficie del organismo o en las células presentes en la secreción infectada. El mayor éxito con este enfoque ha sido en el caso de las infecciones respiratorias en las que una muestra nasofaríngea, de lavado faríngeo, de esputo o de lavado bronquioalveolar puede contener bacterias o agregados virales en cantidades suficientes como para observarse a nivel microscópico. Aunque un marcador fluorescente facilita la búsqueda de los organismos, estos métodos suelen no ser tan sensibles como el cultivo. Con algunos géneros y especies, la detección inmunofluorescente de los antígenos en material clínico proporciona el medio de diagnóstico más rápido, como en el caso de la Legionella y del virus sincitial respiratorio.

Otro método de búsqueda de antígenos es la detección de antígenos libres que el organismo lanza al interior de los líquidos corporales; esto ofrece la posibilidad de pasar por alto las pruebas de análisis directo, cultivo e identificación para alcanzar un diagnóstico. El éxito requiere de un anticuerpo altamente específico, de un método sensible de detección y de la presencia del antígeno homólogo en un líquido corporal accesible. Esto último es una limitación importante, ya que no todos los organismos lanzan antígenos libres durante el curso de la infección. Al momento presente, el diagnóstico por detección de antígenos se encuentra limitado a algunas bacterias y hongos con cápsulas de polisacáridos (p. ej., Haemophilus influenzae), a Chlamydia y a ciertos virus. Las técnicas de aglutinación con anticuerpo ligado a partículas de látex, CIE, RIA e EIA se utilizan para detectar antígenos libres en suero, orina, líquido cefalorraquídeo y sinovial. No se requieren organismos vivos para la detección de antígenos y es posible que estas pruebas arrojen un resultado positivo aun cuando el organismo causante ya haya sido eliminado por medio de terapia antimicrobiana. Estos procedimientos pueden arrojar resultados en un periodo de 1 a 2 horas y, en ocasiones, al cabo de unos pocos minutos. Esa característica resulta atractiva para su uso en consultorios, ya que permite que se tomen decisiones diagnósticas durante la consulta del paciente. Diversos productos comerciales detectan grupos de estreptococos A en gargantas irritadas con una sensibilidad mayor a 90 %; sin embargo, debido a que estas pruebas son menos sensibles que los cultivos, los resultados negativos deben confirmarse mediante estos últimos.

Al igual que en el caso del genoma humano, la secuencia genómica de los principales patógenos humanos se ha determinado o se terminará de determinar en corto tiempo. Estos datos se colocan en bases de datos computarizadas de amplia disponibilidad y ya se han utilizado para una variedad de aplicaciones que van desde la taxonomía hasta la determinación de genes de resistencia microbiana. Algunos de los métodos y aplicaciones pertinentes al estudio de las enfermedades infecciosas se resumen a continuación; al estudiante se le recomienda que consulte textos de biología molecular para un análisis más amplio de estos temas.

Métodos de análisis de ácidos nucleicos

Hibridación y sondas de DNA

Si se abre la doble hélice de DNA dejando un fragmento de DNA de cadena o hebra única (desnaturalizado) se exponen las bases nucleótidas y, así, pueden interactuar con otras moléculas de ácido nucleico de cadena sencilla. Si éstas entran en contacto con secuencias complementarias de una segunda molécula de DNA, se hibridan con ella, formando una segunda molécula de doble cadena en dicha área. Una sonda es un fragmento clonado de DNA que se ha etiquetado a fin de que se pueda detectar si se hibrida con secuencias complementarias en un sistema de prueba de ese tipo (figura 4–16). La sonda se puede derivar del gen de una de las proteínas conocidas del patógeno, o bien derivarse de forma empírica expresamente para propósitos diagnósticos. Los métodos que permiten que se dé la hibridación incluyen aquellos que inmovilizan el DNA blanco de hebra sencilla de una membrana, como en el caso de pruebas de fase sólida o líquida, mismas que pueden realizarse de forma rápida y automatizada. Una variante en la que el DNA se separa por electroforesis en gel de agarosa antes de unirse con la membrana se denomina hibridación de Southern.

Electroforesis en gel de agarosa

Los ácidos nucleicos pueden separarse en un campo electroforético en un gel de agarosa (agar altamente purificado). La velocidad de migración depende del tamaño, donde las moléculas más pequeñas se mueven a mayor velocidad y aparecen en la parte baja (final) del gel. Ese método es capaz de separar fragmentos de DNA en un rango de 0.1 a 50 kilobases, que es mucho menos que el tamaño de los genomas bacterianos, pero que incluye algunos elementos genéticos naturales como los plásmidos bacterianos. Dicho análisis se puede refinar aún más por medio del uso de endonucleasas de restricción, que son enzimas que se derivan de bacterias que reconocen secuencias específicas de nucleótidos en las moléculas de DNA y las digieren (cortan) en todos los sitios en donde aparece la secuencia. Así, los plásmidos de un mismo tamaño se pueden diferenciar por la magnitud de los fragmentos generados por la digestión con endonucleasa del DNA como se muestra en la figura 4–17A–C. La electroforesis en gel de agarosa, la digestión con endonucleasas y la especificidad de la sonda pueden combinarse en las búsquedas de genes de fuente específica como se muestra en la figura 4–18A–E.

Amplificación de ácidos nucleicos

Los métodos de amplificación de ácidos nucleicos (NAA, nucleic acid amplification), tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, polimerase chain reaction) permiten la detección y replicación selectiva de una porción especificada del genoma. La técnica básica de PCR utiliza oligonucleótidos sintéticos como cebadores y DNA polimerasas especiales en una forma que permite ciclos repetidos de síntesis de sólo un segmento de la molécula blanco de DNA que puede ser hasta del tamaño de un genoma completo. La especificidad proviene de una secuencia de cerca de 20 nucleótidos en cada par de cebadores, que están diseñados para flanquear el segmento deseado del genoma. Las DNA polimerasas utilizadas son aquellas que operan a temperaturas inusualmente elevadas, esto permite el uso de la temperatura para controlar los cambios entre la separación de las hebras complementarias de DNA (a fin de que puedan ligarse los cebadores) y la replicación de la secuencia de DNA que se encuentra entre ambos cebadores. Debido a que cada cadena genera un fragmento nuevo, el aumento es exponencial. En un dispositivo denominado termociclador, el DNA especificado puede amplificarse de un millón a 1000 millones de veces en 20 a 30 ciclos (figura 4–19A–D); otros métodos de NAA utilizan los mismos principios.

Aplicación de los métodos de ácidos nucleicos a las enfermedades infecciosas

Genomas bacterianos y virales

Los únicos elementos genéticos intactos de los agentes infecciosos que son lo bastante pequeños para detectarse y medirse por medio de la electroforesis en gel de agarosa son los plásmidos bacterianos. De manera típica, no todas las especies bacterianas contienen plásmidos, pero aquellas que sí lo hacen, tienen uno o varios plásmidos que varían en tamaño de menos de una a más de 50 kilobases. Esta diversidad hace que la presencia o ausencia, número y tamaño de los plásmidos sea de considerable valor en la diferenciación de cepas para propósitos epidemiológicos. Debido a que los plásmidos no son componentes estables del genoma bacteriano, su análisis también tiene el elemento de ser una “instantánea” temporal de las circunstancias del brote de la enfermedad. La especificidad de estos resultados se puede mejorar mediante la digestión de los plásmidos con endonucleasas de restricción antes de la electroforesis. Es posible que dos plásmidos de las mismas dimensiones, pero de cepas distintas, no sean iguales, pero si se genera un patrón idéntico de fragmentos a partir de la digestión, es casi seguro que sí lo sean; estos principios se ilustran en las figuras 4–16 y 4–17.

Debido a su mayor tamaño, los cromosomas de las bacterias deben digerirse con endonucleasas a fin de realizar su resolución en un gel. En el caso de los virus, el resultado es muy similar al de los plásmidos, dependiendo del tamaño genómico y de la endonucleasa que se utilice. Los cromosomas bacterianos digeridos pueden compararse de esta manera, pero el número de fragmentos es muy grande y los patrones complejos. El uso combinado de endonucleasas que hacen cortes poco frecuentes y de métodos electroforéticos capaces de resolver fragmentos de gran tamaño puede producir una comparación similar a la que es posible llevar a cabo con los plásmidos; este enfoque también se utiliza para el análisis de cromosomas múltiples de hongos y parásitos.

Sondas de DNA

Es posible recuperar sondas a partir de procedimientos de NAA o, más comúnmente, se pueden sintetizar como cadena única de nucleótidos (sonda de oligonucleótidos) a partir de datos de secuencia conocidos. Pueden contener un gen de función conocida o simplemente secuencias que en forma empírica han resultado de utilidad para la aplicación en cuestión. Cuando se etiquetan con un radioisótopo u otro marcador y se utilizan en reacciones de hibridación, permiten detectar las secuencias homólogas en especímenes desconocidos (figura 4–16) o refinar aún más los hallazgos de electroforesis en gel (figura 4–18).

En términos diagnósticos, las sondas de DNA se utilizan para detectar o identificar microorganismos mediante la hibridación de la sonda con secuencias homólogas del DNA extraído del organismo completo. Se ha desarrollado un número de sondas que de manera rápida y confiable identifican organismos ya aislados por cultivo. La aplicación de sondas para la detección de agentes infecciosos de manera directa en muestras clínicas como sangre, orina y esputo es más difícil porque existe la posibilidad de que sólo esté presente un número pequeño de los organismos. Este problema de sensibilidad se aborda mediante la combinación de las sondas con los métodos de NAA (véase más adelante), dicha técnica ofrece el potencial para el diagnóstico rápido y la detección de características que no es posible determinar mediante el uso de los métodos de rutina; por ejemplo, una sonda para el gen de una toxina bacteriana permite demostrar, sin la necesidad de un cultivo, tanto la presencia del organismo relacionado como su toxigenicidad.

Aplicaciones de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

El poder de amplificación de la PCR ofrece una solución al problema de sensibilidad inherente en la aplicación directa de sondas en especímenes clínicos. El segmento de ácidos nucleicos amplificado por la PCR se detecta mediante hibridación directa con la sonda (figura 4–19D2) o para una mayor especificidad después de electroforesis y transferencia de Southern (figura 4–19D3, D4). Este enfoque ha resultado exitoso para una amplia variedad de agentes infecciosos y únicamente requiere de una mayor resolución de problemas prácticos para un uso más amplio.

Otro uso creativo de la PCR ha sido en el estudio de agentes infecciosos observados en tejidos, pero no reproducidos en cultivo. Los cebadores de PCR derivados de secuencias conocidas como altamente conservadas entre las bacterias, como es el caso del RNA ribosómico, se han aplicado a muestras de tejido. La amplificación produce cantidades suficientes de DNA para clonar y secuenciar. Más tarde, es factible comparar esta secuencia con las secuencias publicadas para otros organismos en computadoras. Así, es posible inferir relaciones taxonómicas para un organismo que nunca se haya aislado en cultivo.

Ribotipificación

La ribotipificación también hace uso de la naturaleza conservada del RNA ribosómico bacteriano y de la capacidad del RNA para hibridarse con el DNA bajo ciertas condiciones. El RNA ribosómico etiquetado de un organismo puede hibridarse con el DNA cromosómico digerido con endonucleasa de otro. En este caso, el RNA ribosómico se está utilizando como sonda masiva de fragmentos de restricción separados por electroforesis. La hibridación a fragmentos múltiples es común pero, si los organismos son genéticamente distintos, los fragmentos de restricción, que contienen las secuencias de RNA ribosómico, variarán en cuanto a tamaño. Después, es posible comparar los patrones de bandas producidos por cepas epidemiológicamente emparentadas.

La aplicación de alguna combinación de los principios descritos en el presente capítulo es apropiada para el diagnóstico de cualquier enfermedad infecciosa. La utilidad de cualquiera de los métodos por sí mismo difiere entre los agentes infecciosos a causa de la variación biológica y la asimetría de su estudio. En general, para aquellos agentes que pueden desarrollarse in vitro, el cultivo sigue siendo la “norma de oro” como el método tanto más sensible como más específico. Los métodos moleculares tienen el potencial de reemplazar a los cultivos y lo han hecho en ciertas áreas, en especial en virología. Además del costo, su aplicación más amplia en el diagnóstico de las enfermedades infecciosas debe considerar su naturaleza altamente específica. Dependiendo de la situación clínica, la muestra que se discute al inicio del presente capítulo podría referirse a una pregunta muy estrecha o muy amplia. Si la pregunta se limita al diagnóstico de una lista corta de enfermedades (sida, gonorrea, tuberculosis, paludismo), un enfoque de sonda de DNA es rápido, sensible y práctico. No obstante, muy a menudo la pregunta es “casi cualquier cosa” o al menos una amplia gama de posibilidades. Las plataformas de PCR múltiple pueden extender la utilidad de los métodos de NAA; no obstante, es difícil reemplazar el cultivo por completo porque ofrece detección más amplia de lo común, junto con una probabilidad razonable de detectar las infecciones poco comunes e incluso las raras.